非黑素瘤細(xì)胞性皮膚腫瘤的中醫(yī)分型與人類乳頭瘤病毒的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：參照朱仁康主編的《中醫(yī)外科學(xué)》里中醫(yī)辨證分型相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)非黑素瘤細(xì)胞性皮膚腫瘤(nonmelanomaskincancer)患者進(jìn)行中醫(yī)證型分組，采用常規(guī)聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerasechainreaction)和巢式聚合酶鏈反應(yīng)(NestedPolymeraseChainReaction)的方法來檢測(cè)NMSC患者組織標(biāo)本中的一類特殊型HPV(EV型)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNA進(jìn)行測(cè)序，旨在研究NMSC中醫(yī)證型與HPV感染是否存在相關(guān)

2、性。 材料：標(biāo)本來源于武漢市第一醫(yī)院皮膚科門診，40名患者均經(jīng)過臨床和組織病理確診為NMSC。其中包括：①新鮮手術(shù)組織標(biāo)本20例：鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma)8例，基底細(xì)胞瘤(basalcellcarcinoma)12例。手術(shù)切下組織后立刻保存于-70℃冰箱。②NMSC石蠟包埋組織標(biāo)本20例：SCC15例，BCC5例。方法：1.分組：參照《中醫(yī)外科學(xué)》[1]里中醫(yī)辨證分型標(biāo)準(zhǔn)將NMSC患者分成四組，其

3、中瘡感風(fēng)毒型11例、肝火血燥型6例、元?dú)馓撊跣?5例、肝腎虧損型8例。 2.新鮮手術(shù)標(biāo)本DNA的提?。孩倜?-5mg組織研磨后加入200ul1號(hào)緩沖液和30ul蛋白酶K(10mg/ml)，37℃孵育，24小時(shí)后加10mg/l蛋白酶K30ul，繼續(xù)孵育24小時(shí)；95℃水浴加熱10min，得到DNA粗提物。②DNA粗提物經(jīng)過酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等純化沉淀洗滌干燥等得到模板DNA。 3.新鮮手術(shù)標(biāo)本的擴(kuò)增：采用EV型

4、通用引物CP65-CP70(CP65:5'CA(A/G)GGTCA(C/T)AA(C/T)AATGG(C/T)AT3'，CP70:5'AA(C/T)TTTCGTCC(C/T)A(A/G)AG(A/G)A(A/T)ATTG(A/G)TC3'，分別位于HPV-8基因組序列的6832-6851和7273-7298位置)和CP66-CP69(CP66:5'AATCA(A/G)(A/C)TGTTT(A/G)TTAC(A/T)GT3'，CP69:5

5、'G(A/T)TAGATC(A/T)ACAT(C/T)CCA(A/G)AA3'分別位于HPV-8基因組序列的6862-6881和7231-7250位置)對(duì)新鮮手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行巢式PCR，擴(kuò)增HPVDNA。CP65-CP70擴(kuò)增后得到目的片段為452-467bp的產(chǎn)物；然后用CP66-CP69進(jìn)行第2步擴(kuò)增得到目的片段為370bp左右的終產(chǎn)物。 4.石蠟包埋組織標(biāo)本的DNA提?。孩偾?0um厚石蠟包埋組織標(biāo)本的切片5片，二甲苯脫蠟、乙

6、醇洗滌，干燥后加TES緩沖液500μl、30ul蛋白酶K(10mg/ml)溶液和30u120％的SDS，56℃水浴72h，每24h加入等量蛋白酶K(30ul)一次。95℃水浴加熱10min，得到DNA粗提物。②DNA粗提物經(jīng)過酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等純化沉淀洗滌干燥等得到模板DNA。 5.石蠟包埋組織標(biāo)本的擴(kuò)增：①用HPV通用引物FAP59/FAP64(FAP59:5，TAAC(T/C)GTIGGICA(C/T)CC(T

7、/C)TATT-3'，F(xiàn)AP64:5，CC(T/C)ATATC(T/C)(A/C/G)(A/C/T)CATITCICCATC3')對(duì)石蠟包埋組織標(biāo)本DNA擴(kuò)增。 6.β-Globin1，β-Globin2參照PCR：β-Globin1andβ-Globin2(β-Globin1:5'CAACTTCATCCACGTTCACC3'，β-Globin2:5'GAAGAGCCAAGGACAGGTAC3)引物作為參照PCR，用于驗(yàn)證DNA

8、模板的質(zhì)量。 7.對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上的已知序列進(jìn)行對(duì)比、分型。 8.分析檢測(cè)的HPVDNA陽性結(jié)果，對(duì)比中醫(yī)證型分組，比較各證型與HPVDNA陽性率高低有無相關(guān)性。 結(jié)果：20例NMSC患者新鮮手術(shù)組織標(biāo)本經(jīng)引物CP65-CP70和CP66-CP69進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，有6個(gè)標(biāo)本出現(xiàn)約370bp左右的條帶。其中8個(gè)SCC標(biāo)本中陽性的有3個(gè)，占37.55％，12個(gè)BCC標(biāo)本中陽性標(biāo)本

9、有3個(gè)占25％，6例中屬于正虛組的標(biāo)本有5例陽性，其中元?dú)馓撊踝C4個(gè)、肝腎虧損證1個(gè)，邪實(shí)組中僅瘡感風(fēng)毒證1個(gè)。石蠟包埋組織標(biāo)本分別用HPV通用引物FAP59/FAP64擴(kuò)增，有5個(gè)標(biāo)本出現(xiàn)約240bp條帶，15個(gè)SCC標(biāo)本中陽性標(biāo)本4個(gè)，占26.7％，5個(gè)BCC標(biāo)本中陽性的有1個(gè)，占20％，5例陽性全部屬于正虛組其中元?dú)馓撊踝C4個(gè)、肝腎虧損證1個(gè)。 對(duì)PCR進(jìn)行產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank上的己知序列進(jìn)行對(duì)比、分型，結(jié)果

10、均為HPV-5。 結(jié)論：1.我科門診NMSC患者中感染HPV的患者主要集中在元?dú)馓撊踝C和肝腎虧損這2種正虛的證型上，其它尚有一例瘡感風(fēng)毒型HPV陽性患者。采用x2檢驗(yàn)精確概率法計(jì)算得P＜0.01，所以正虛組的NMSC患者HPV陽性感染率與邪實(shí)組有明顯差異。HPV感染與NMSC中醫(yī)辨證為正虛類型患者存在一定相關(guān)性。 2.測(cè)序結(jié)果均為HPV-5，表明HPV亞型與中醫(yī)宏觀辨證分型不存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。 3.標(biāo)本中8例SCC患