Nedd化與皮膚黑素瘤發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、黑素瘤是皮膚科致死率最高的惡性腫瘤，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，且不易受化療藥物的干擾，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。目前黑素瘤的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。連接態(tài)NEDD8與多種惡性腫瘤的發(fā)生有相關(guān)性，與黑素瘤的關(guān)系尚未見研究報(bào)道。本研究旨在探討連接態(tài)NEDD8在黑素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 (1)連接態(tài)NEDD8在黑素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)
　　 為了探討連接態(tài)NEDD8是否參與了皮膚黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程，利用westemblot方法檢測了皮膚黑

2、素瘤組織和痣組織、正常人黑素細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞株中連接態(tài)NEDD8的表達(dá)量。結(jié)果顯示，與黑素瘤瘤旁組織和痣組織相比，連接態(tài)NEDD8在皮膚黑素瘤瘤組織中的表達(dá)明顯上調(diào)；與正常人黑素細(xì)胞相比，連接態(tài)NEDD8在黑素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)明顯上調(diào)，其在M14細(xì)胞中的上調(diào)最為明顯。連接態(tài)NEDD8在黑素瘤組織和黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)均增多，表明其很有可能參與了皮膚黑素瘤發(fā)病的某個(gè)環(huán)節(jié)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。為了進(jìn)一步探討連接態(tài)NEDD8對黑素瘤的影響，我

3、們將在實(shí)驗(yàn)的第三、第四部分，利用shRNA干擾技術(shù)對其進(jìn)行深入的研究。
　　 (2)與連接態(tài)NEDD8的形成密切相關(guān)的酶蛋白在黑素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)
　　 連接態(tài)NEDD8的形成需要經(jīng)過一系列酶的催化作用，這些酶主要包括NEDD8、APP-BP1、UBA3、UBC12以及UCH-L。為了了解皮膚黑素瘤中與連接態(tài)NEDD8密切相關(guān)的催化酶的表達(dá)情況與及其與連接態(tài)NEDD8升高的關(guān)系，并且為第三部分實(shí)驗(yàn)選擇RNAi干擾的目標(biāo)，

4、我們利用real-timePCR技術(shù)檢測了黑素瘤細(xì)胞株中NEDD8、APP-BP1、UBA3、UBC12以及UCH-L3的表達(dá)。結(jié)果顯示與正常人黑素細(xì)胞相比，NEDD8、APP-BP1、UBA3、UBC12以及UCH-L3在黑素瘤細(xì)胞株中的表達(dá)幾乎均明顯升高，其中以M14細(xì)胞株中的UBA3升高最為顯著。結(jié)果表明，這些與連接態(tài)NEDD8的形成密切相關(guān)的蛋白與黑素瘤細(xì)胞株中連接態(tài)NEDD8的上調(diào)可能具有相關(guān)性。
　　 (3)shRN

5、A-UBA3重組質(zhì)粒的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　 從第一分的實(shí)驗(yàn)中觀察到，M14細(xì)胞中連接態(tài)NEDD8上調(diào)最為明顯；在第二部的實(shí)驗(yàn)中觀察到，與Nedd化密切相關(guān)的多種催化酶中，M14細(xì)胞的UBA3表達(dá)最高。因此在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們選擇對M14細(xì)胞中的UBA3來進(jìn)行干擾，以此來阻斷M14細(xì)胞中的連接態(tài)NEDD8的形成，為下一步研究Nedd化對黑素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響打下基礎(chǔ)。本部分實(shí)驗(yàn)中我們構(gòu)建了shRNA-UBA3與pRNAT-U6

6、.2/Lenti的重組質(zhì)粒載體，并用其轉(zhuǎn)染M14細(xì)胞株，經(jīng)過單克隆篩選后得到穩(wěn)定表達(dá)shRNA-UBA3的細(xì)胞株，采用免疫細(xì)胞化學(xué)和westemblot技術(shù)，證實(shí)轉(zhuǎn)染后M14細(xì)胞中UBA3的表達(dá)明顯下降，連接態(tài)NEDD8的表達(dá)下調(diào)明顯。實(shí)驗(yàn)表明干擾UBA3的表達(dá)可以顯著降低細(xì)胞中連接態(tài)NEDD8的形成。在接下來的實(shí)驗(yàn)中我們將對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)行為的研究，探討Nedd化對黑素瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的形象。
　　 (4)

7、Nedd化對M14細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 以轉(zhuǎn)染前的M14細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的M14細(xì)胞為對照，研究連接態(tài)NEDD8下調(diào)后的M14細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)第三部分成功篩選）其細(xì)胞生物學(xué)行為有何變化。經(jīng)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的觀察發(fā)現(xiàn)，干擾連接態(tài)NEDD8的形成后，M14細(xì)胞的在體外的增殖能力明顯受到抑制，發(fā)生了G1期阻滯，且細(xì)胞的侵襲能力也發(fā)生了明顯的下降。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，接種轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，瘤體在裸鼠

8、中的增長速度和程度明顯受到抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連接態(tài)NEDD8與細(xì)胞的增殖能力和侵襲能力密切相關(guān)，高表達(dá)的連接態(tài)NEDD8將會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力。
　　 結(jié)論：
　　 NEDD8與cullin蛋白的連接可能是黑素瘤細(xì)胞無序增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原因之一。在黑素瘤細(xì)胞及皮膚黑素瘤組織中，連接態(tài)的NEDD8明顯上調(diào)，阻斷NEDD8與cullin蛋白的連接會明顯降低M14細(xì)胞的增殖及侵襲能力，并且會對其細(xì)胞周期的進(jìn)程產(chǎn)生影