厚樸雜交親本及子代遺傳多樣性分析.pdf

1、厚樸（Magnolia officinalis）為落葉喬木，隸屬于木蘭科（Magnoliaceae）木蘭屬(Magnolia)，為我國(guó)三大木本藥材之一，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域的亞熱帶及北熱帶地區(qū)。厚樸因其具有重要藥用價(jià)值，在20世紀(jì)80年代被過(guò)度采挖利用，致使野生植株數(shù)量驟減，生境呈現(xiàn)片斷化，近年來(lái)的研究表明厚樸自然居群間的基因交流受阻，生存現(xiàn)狀令人擔(dān)憂，開(kāi)展厚樸種群遺傳多樣性保護(hù)和恢復(fù)工作迫在眉睫。
　　基于對(duì)

2、厚樸遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的了解，本研究在厚樸不同種群間進(jìn)行雜交授粉試驗(yàn)，利用SSR分子標(biāo)記手段對(duì)獲得的厚樸雜交子代，雜交親本以及親本的自由授粉子代個(gè)體檢測(cè)其遺傳多樣性，從分子水平揭示厚樸子代和雜交親本的遺傳多樣性水平及差異，并提出下一步保護(hù)策略，主要研究結(jié)果如下:
　　(1)厚樸SSR引物篩選及反應(yīng)體系優(yōu)化
　　在SSR引物篩選基礎(chǔ)上，利用正交設(shè)計(jì)對(duì)影響PCR反應(yīng)的5個(gè)因素濃度（模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs及Taq

3、酶）進(jìn)行4水平的優(yōu)化，并通過(guò)溫度梯度優(yōu)化引物退火溫度。在厚樸和近緣物種的70對(duì)引物中，篩選出13對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性豐富的SSR引物。PCR各因素在不同水平下對(duì)反應(yīng)體系的影響大小依次為:引物＞Taq酶＞Mg2+＞dNTPs＞模板DNA;PCR最佳優(yōu)化體系為:25μL體系中，模板DNA2 ng·μL-1，引物0.6μmol·L-1，Mg2+2.0 mmol·L-1，dNTPs0.5 mmol·L-1，Taq酶0.03 U·μL-1;最佳

4、擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，48～59℃（退火溫度隨引物不同而定）退火30s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸10min。
　　(2)厚樸雜交親本、雜交子代及自由授粉子代遺傳多樣性分析
　　利用13對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)厚樸不同種群間控制授粉雜交子代、雜交親本及親本自由授粉子代共16個(gè)群體/組合進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明:13對(duì)引物共擴(kuò)增出73條帶，13個(gè)位點(diǎn)全部表現(xiàn)多態(tài)性;遺傳多樣性高低順序

5、為雜交子代（I=1.4544，Nei=0.7193，He=0.7287）＞雜交親本(I=1.3958，Nei=0.6899，He=0.6955)＞自由授粉子代(I=1.2118，Nei=0.6423，He=0.5910)，雜交子代遺傳多樣性水平顯著高于自由授粉子代;自由授粉子代群體Fis值在13個(gè)位點(diǎn)上只有Stm0246和M6D10兩個(gè)位點(diǎn)為負(fù)數(shù)，其余位點(diǎn)為正，表現(xiàn)為純合子過(guò)剩而雜合子明顯不足，即自由授粉子代可能存在較高程度的近交;親本

6、間遺傳距離與雜交子代遺傳多樣性之間呈正相關(guān)，但相關(guān)性未達(dá)到顯著水平(R=0.3924);根據(jù)Nei遺傳距離對(duì)親本及子代進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)，可分成三類(lèi)，雜交子代與父本親緣關(guān)系更近。雜交子代遺傳多樣性高于自由授粉子代，說(shuō)明人為控制授粉促進(jìn)了厚樸群體間基因交流，拓寬了群體遺傳基礎(chǔ)，也證明通過(guò)人為控制授粉加速厚樸種群間基因流的保護(hù)措施具有可行性，在對(duì)瀕危種群進(jìn)行雜交的保護(hù)工作時(shí)，親本間遺傳距離對(duì)親本選配有一定參考價(jià)值，研究結(jié)果為厚樸保護(hù)生物學(xué)研