中國野芥菜遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、野芥菜（wild Brassica juncea）為十字花科蕓薹屬一年或兩年生雜草，經(jīng)過查閱文獻和實地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，野芥菜已廣泛分布于我國16個省的麥田、油菜田、路邊、花壇及荒地等生態(tài)環(huán)境中，危害日趨嚴重?，F(xiàn)有芥菜的研究主要集中于栽培種，對野生種的研究非常少，目前野芥菜的分類地位尚沒有確定，因此拉丁名的使用不一致，常使用的拉丁名有B.juncea(L.) Czern.et Coss、B.juncea vat.gracilis Tsen et

2、 Lee;同時全國范圍內(nèi)野芥菜的遺傳多樣性及結(jié)構(gòu)不清楚，因此有必要對全國范圍內(nèi)的野芥菜的“種”以下分類地位、遺傳多樣性及不同地區(qū)間的遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，為探討野芥菜的起源和進化提供理論依據(jù)。
　　本實驗室人員對野芥菜分布地區(qū)進行系統(tǒng)調(diào)查，并采集了來自于中國13個省份的25個居群，每個居群10個個體共250份野芥菜植株標本和種子樣本。此外，還收集了德國野芥菜、美國野芥菜、油用的大葉芥油菜（B.juncea vat.juncea）、菜用

3、的芥菜雪里紅（B.juncea var.multiceps）、禹氏三角中的3個基本種蕓薹（B.campestris）、黑芥(B.nigra)、甘藍(B.oleracea)以及復合種歐洲油菜(B.napus)和埃塞俄比亞芥(B.carinata)的植株。在南京農(nóng)業(yè)大學牌樓試驗基地對上述材料進行種植，采集幼苗期葉片提取DNA，對上述材料的核基因組ITS（內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)）和RPS2（抗丁香假單胞菌基因）序列進行擴增，并結(jié)合從NCBI庫中下載的多

4、裂葉芥(B.juncea var.multisecta)、榨菜(B.juncea var.tumida)、大頭菜(B.junceavar.megarrhiza)、小葉芥油菜（B.junceavar.gracilis）的ITS序列和外類群擬南芥(Arabidopsis thaliana)的ITS和RPS2序列進行野芥菜分類地位研究;自行開發(fā)了12對野芥菜核基因組的簡單重復序列標記(SSR，simple sequence repeat)，利

5、用其中的11對引物對25個野芥菜居群進行了遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析。
　　對上述材料的ITS和RPS2序列進行分析，并采用最大簡約法(Maximumparsimony method, MP)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行聚類分析。結(jié)構(gòu)表明ITS序列比對長度為614bp，變異位點為56bp(9.12％)，簡約信息位點為34bp(5.53％);RPS2序列比對長度為1019bp，變異位點為116bp(11.38％)，簡約信息位點為87bp(8.5

6、4％)。在MP樹上，野芥菜及其近緣種可聚為2個分支。第一分支為甘藍與埃塞俄比亞芥，支持率為81％;其他物種以58％的支持率聚為第二分支。第二分支內(nèi)，又分為2個亞分支，美國野芥菜、德國野芥菜、黑芥及小葉芥油菜、榨菜以84％的支持率形成第一亞分支;其余物種聚合成第二亞分支，支持率為84％。第二亞分支中蕓薹、歐洲油菜、西藏野芥菜以52％支持率聚合，大葉芥油菜及雪里紅、多裂葉芥、大頭菜與除西藏野芥菜外的其他野芥菜各居群呈現(xiàn)平行的姐妹類群關(guān)系。上

7、述系統(tǒng)發(fā)育樹表明中國野芥菜與雪里紅、多裂葉芥和大葉芥油菜親緣關(guān)系較近。結(jié)合前人的觀點，即野芥菜是芥菜型油菜的逸生種或芥菜型油菜的野生種，本實驗更傾向于使用B.Junea var.juncea作為野芥菜的拉丁名或把野芥菜作為新的變種進行重新定名。
　　應用RPS2序列對25個中國野芥菜居群進行鑒別位點分析，結(jié)果顯示，根據(jù)10個位點，可將25個居群分為2大類，一類為穩(wěn)定具有這10個位點的采自于西藏、新疆、青海、四川、貴州、河南地區(qū)的1

8、2個居群，另一類為這10個位點分別發(fā)生了相同變異的采自于陜西、江西、湖北、湖南、安徽、江蘇、浙江地區(qū)的13個居群。
　　由于野芥菜居群間的ITS序列沒有差異，因此以ITS和RPS2序列共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的支持率較低，無法清晰地揭示野芥菜居群間的遺傳關(guān)系。因此選擇使用有變異位點的RPS2序列單獨構(gòu)樹。以擬南芥為外類群基于RPS2序列使用UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示黑芥和2個德國野芥菜居群聚為第一分支，中國野芥菜各居群、栽培

9、芥菜（大葉芥油菜、雪里蕻）和蕓薹聚為第二分支。第二分支可分為三個亞支，其中蕓薹、西藏野芥菜和新疆野芥菜聚為第一亞支;河南、四川、貴州、青海4省的8個野芥菜居群聚為第二亞支;湖南、湖北、江西、陜西、安徽、江蘇、浙江7省13個野芥菜居群和2個栽培芥菜品種（大葉芥油菜和雪里紅）聚為第三亞支。RPS2序列的單倍型分析結(jié)果與上述結(jié)果相同?；谏鲜鱿到y(tǒng)發(fā)育樹認為中國野芥菜的RPS2序列起源于西藏和新疆地區(qū)。
　　通過RPS2序列可知，25個中

10、國野芥菜居群間的遺傳距離為0-0.033，核苷酸多樣性指數(shù)Pi為0.01302，居群間遺傳分化系數(shù)Nst為0.959，基因流Nm為0.01，顯示了中國分布野芥菜居群間遺傳變異達95.93％,居群內(nèi)遺傳變異僅為4.07％,居群間基因交流少。
　　采用雙抑制PCR法設(shè)計野芥菜的微衛(wèi)星引物，用以研究野芥菜各居群的群體遺傳學。將設(shè)計的12對引物在四川南充和江蘇江浦兩個居群各20個個體中擴增，結(jié)果表明12對微衛(wèi)星引物均具有多態(tài)性。每個位點的

11、等位基因的范圍是4-27個，平均等位基因數(shù)是15.2個。利用設(shè)計的微衛(wèi)星引物對野芥菜各居群遺傳變異和遺傳結(jié)構(gòu)進行研究，對探討野芥菜遺傳多樣性和進化模式具有重要意義。
　　本研究利用上述12對中的11對多態(tài)性的SSR引物對25個中國野芥菜居群進行遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)的研究。研究結(jié)果顯示，在中國野芥菜群體中共檢測到了90個等位基因，表明其具有較高的遺傳多樣性水平。Shannon多樣性指數(shù)(I)在0.355-0.610之間，平均為0

12、.45。遺傳多樣性指數(shù)(Hs)在0.241-0.503之間，平均為0.319。NJ聚類分析和主成分分析(PCoA)結(jié)果表明25個居群分化為兩個獨特的遺傳譜系（南譜系Southern Lineage和北譜系Northern Lineage），并具有特定的地理分布。北譜系包括起源地西藏、新疆，安徽北部和江蘇北部和黃河流域的青海、陜西、河南。南譜系包括長江流域的四川、貴州、江西、湖北、湖南、浙江。在不考慮安徽、江蘇長江以北的野芥菜居群的情況下