枇杷葉三萜酸對(duì)慢性支氣管炎防治作用的細(xì)胞分子機(jī)制研究.pdf

1、目前對(duì)慢性支氣管炎的治療主要著眼于抗炎、鎮(zhèn)咳、平喘作用的研究，至今尚無令人十分滿意的藥物。而對(duì)于改善機(jī)體免疫功能狀態(tài)的免疫調(diào)節(jié)藥物，尤其是具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥的研究還沒有引起足夠的重視。本課題組前期在國家自然科學(xué)基金的資助下(NO：30371766)證實(shí)楷杷葉的有效活性部位為三萜酸。枇杷葉三萜酸(TAL)具有明顯的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)慢支具有防治作用。 鑒于慢性支氣管炎免疫功能紊亂的病理機(jī)制和枇杷葉三萜酸(TAL)高效、低毒

2、的作用特征，基于AM在慢支發(fā)病中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)以肺泡巨噬細(xì)胞(AM)為研究靶點(diǎn)，探討TAL對(duì)慢性支氣管炎防治作用的細(xì)胞分子機(jī)制，為將其開發(fā)為治療慢支的新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。前期研究表明TAL灌胃給藥可明顯降低慢支大鼠肺組織勻漿中TNF-α、IL-8水平，升高IL-10的表達(dá)，并對(duì)慢支大鼠氣道粘膜上皮細(xì)胞NF-kB、ICAM-1的蛋白表達(dá)具有一定的抑制作用。TAL能明顯抑制慢支大鼠AM自由基的產(chǎn)生[5]；抑制炎癥介質(zhì)PGE2及LTB4的合

3、成及釋放[6]；抑制AM中iNOS的表達(dá)及NO的合成；此外通過抑制NF-kB表達(dá)及活化，降低AM中TNF-α、IL-1的表達(dá)和分泌[7]。TAL既能抑制AM細(xì)胞因子(TNF-α、IL-8、IL-1)炎癥介質(zhì)(PGE2、LTB4)的表達(dá)又明顯抑制AM自由基、iNOS的合成。但AM是如何被激活的以及炎性介質(zhì)的生成與釋放機(jī)制一即基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯是如何調(diào)控的目前還不明了。因此進(jìn)一步研究AM等細(xì)胞激活的分子機(jī)制是CB發(fā)病機(jī)制研究的主要方向。鑒于M

4、APK信號(hào)傳導(dǎo)通路在炎癥反應(yīng)中的重要作用，本課題旨在前期研究的基礎(chǔ)上，以AM為平臺(tái)，MAPK信號(hào)通路為研究對(duì)象，研究慢支大鼠AM MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，探討TAL對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響，研究TAL對(duì)慢支大鼠AM凋亡的影響，從而進(jìn)一步闡明TAL對(duì)慢性支氣管炎防治作用的細(xì)胞分子機(jī)制，為將其開發(fā)為治療慢支的新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。課題為國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：30572355)。 研究內(nèi)容主要包括以下三個(gè)方面： 1.慢支模

5、型大鼠肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的MAPK信號(hào)通路研究MAPK三條通路的特異性阻制劑均能顯著抑制慢支模型大鼠AM異常增加的IL-1、TNF-α活性，而JNK，ERK MAPK通路的特異性阻制劑Curcumin，PD98059能顯著抑制慢支模型大鼠AM異常增加的PGE2活性(P<0.01)。JNK,ERK MAPK通路的特異性阻制劑可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)(P<0.01 or P<0.05)。p38 MA

6、PK通路的特異性阻制劑SB203580體外給藥可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)HO-1mRNA表達(dá)而p38，JNK MAPK通路的特異性阻制劑SB203580及Curcumin可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)(P<0.0lorP<0.05)。MAPK三條信號(hào)傳導(dǎo)通路阻制劑體外給藥均可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)TNF-α mRNA表達(dá)，而JNK，p38 MAPK通路的特異性阻制劑Curcumin，SB203580可顯著抑制CB大鼠AM內(nèi)TNF

7、-α蛋白表達(dá)(P<0.05)。提示慢支大鼠AM中細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)(COX-2、TNF-α、HO-1、IL-1、PGE2)的表達(dá)及活性分別由不同的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)。MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路可分別從轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)。 2.慢支大鼠肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路及TAL的作用環(huán)節(jié)研究分別應(yīng)用MAPK通路上游信號(hào)蛋白(PTK、P13K、Akt、PKC)的特異性阻制劑預(yù)處理AM，觀察下游蛋白磷酸化水平，以確定

8、轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)蛋白。結(jié)果顯示：Genistein可以不同程度的抑制PKC、P13K/Akt、MAPK通路磷酸化的程度；LY294002可以抑制P13K/Akt磷酸化的水平，同時(shí)誘導(dǎo)p-p38、p-JNK的高表達(dá)，對(duì)PKC/ERK這條經(jīng)典途徑的磷酸化也有一定的激活作用：CalphostinC阻斷PKC的磷酸化，對(duì)P-ERK水平有較大影響，而對(duì)p-p38和p-JNK則影響不大。推出慢支模型大鼠AM中LPS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)MAPK通路可能為PTK

9、-----P13K/Akt-----JNK/P38或者PTK-----P13K-----PKC-----ERK。進(jìn)一步探討了TAL對(duì)MAPK通路的轉(zhuǎn)錄前信號(hào)蛋白的作用環(huán)節(jié)。發(fā)現(xiàn)TAL對(duì)-p38，p-JNK，p-ERK，p-PKC，p-Akt皆有一定抑制作用(其中對(duì)p38和JNK磷酸化水平的抑滯效應(yīng)最為顯著)，而對(duì)p-P13K，其作用不甚明顯，同時(shí)，TAL對(duì)模型組TLR4受體水平的增高也沒有明顯的降低作用。也就證明TAL，對(duì)MAPK調(diào)控可

10、能發(fā)生在P13K下游某個(gè)環(huán)節(jié)，具體機(jī)制還有待研究。 3.TAL對(duì)慢支模型大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的影響及其可能的作用機(jī)制研究與正常組比較，模型大鼠AM凋亡率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，TAL給藥組及ERK通路抑制劑PD98059組AM凋亡率顯著升高(P<0.05 orP<0.01)。而JNK通路抑制劑Cureumin組AM凋亡率顯著降低(P<0.05)。進(jìn)一步研究顯示，模型大鼠AM Bax表達(dá)降低而Bel-2表達(dá)升高(P<0.0

11、1)；TAL給藥組可顯著升高慢支大鼠AM Bcl-2表達(dá)而降低Bax表達(dá)(P<0.05 0r P<0.01)。TAL抑制慢支大鼠AM胞漿內(nèi)游離鈣濃度升高，可使慢支大鼠AM激活數(shù)量減少。TAL能明顯誘導(dǎo)AM的凋亡，降低AM的活性，使AM的數(shù)量減少，活性降低，從而發(fā)揮防治慢支的作用。MAPK通路參與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，其中ERK通路可能抑制細(xì)胞凋亡而JNK通路發(fā)揮促凋亡的作用。TAL對(duì)慢支大鼠AM的促凋亡作用可能與其調(diào)節(jié)AM Bel-2/Bax