金水寶膠囊對慢性支氣管炎大鼠炎癥因子的作用機制研究.pdf

1、目的：金水寶膠囊（每粒含蟲草菌粉0.33g）系冬蟲夏草分離所得蟲草菌的發(fā)酵制品。冬蟲夏草甘溫，入肺、腎經(jīng)，具有補腎保肺、秘精益氣之功效，對慢性支氣管炎（chronic bronchitis，CB）具有較好的治療效果，但其治療作用機制尚未完全明確。本研究采用氣管內(nèi)滴注脂多糖（LPS）的方法復(fù)制CB大鼠模型，然后給予藥物干預(yù)，檢測大鼠血清、肺組織中促炎細胞因子腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素（IL-1β）及抗炎細胞因子IL-4、IL-

2、10的含量變化，運用HE染色和SP免疫組織化學(xué)染色等技術(shù)手段，觀察CB狀態(tài)下支氣管、肺組織病理形態(tài)學(xué)特征及金水寶膠囊對肺組織中cNOS表達的影響，探討其作用機理。
　　 方法：SD大鼠40只，按體重隨機分為正常對照組（對照組，normal group）、CB模型組（模型組，model group）、金水寶低劑量組（低劑量組，low-dose group）、金水寶高劑量組（高劑量組，high-dose group）和桂龍咳喘寧對照

3、組（桂龍組，guilong group，陽性對照用藥）。每組8只，雌雄各半。
　　 各組大鼠用1％的戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射，麻醉成功后，使其仰臥固定于操作臺，暴露聲門，以靜脈套管針代替氣管導(dǎo)管，拔除針芯，快速插入氣管，將LPS200μg注入氣管內(nèi)；對照組大鼠氣管內(nèi)滴入無菌生理鹽水0.5ml/只。喂養(yǎng)3周。
　　 從第四周開始，對照組和模型組灌服生理鹽水，容量為10ml/kg；低劑量組和高劑量組每日用藥劑量分

4、別為0.3g/kg（相當(dāng)于臨床成人用藥量的7倍）、0.6g/kg（相當(dāng)于臨床成人用藥量的14倍），以0.03g/ml和/或0.06g/ml的混懸液灌胃；桂龍組每日用藥劑量0.9g/kg（相當(dāng)于臨床成人用藥量的14倍），以0.09g/ml的混懸液灌胃。以上均為每日1次，連續(xù)3周。
　　 檢測樣本制備：灌藥3周結(jié)束后第2天，斷頭取血，立即以3500r/min離心5min，取血清，-20℃凍存待檢。
　　 肺組織勻漿的制備：將

5、肺組織用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸濕后，稱取濕重0.3g左右，加入預(yù)冷的生理鹽水，用電動勻漿器研磨，鏡檢未見完整細胞，制成10％的肺組織勻漿。4℃6000r/min離心5min，提取上清液，用雙縮脲法測定蛋白含量，-20℃凍存待檢。
　　 取右側(cè)肺臟中部組織0.5cm×0.5cm，用10％甲醛（pH7.4磷酸鹽緩沖液配制）固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。
　　 結(jié)果：
　　 1.CB大鼠支氣管、肺組織病理形態(tài)學(xué)改變

6、　　 對照組可見細支氣管粘膜上皮完整，細胞排列整齊，細支氣管壁及肺泡無明顯病理形態(tài)學(xué)改變（見Fig.1、2、3）。模型組可見細支氣管管腔增大，部分上皮細胞壞死脫落，周圍可見大量以淋巴細胞為主的慢性炎細胞浸潤。肺泡上皮細胞部分壞死脫落，肺泡間隔明顯增寬，伴有慢性炎細胞及少量中性粒細胞浸潤等（見Fig.4、5、6）。
　　 2.金水寶膠囊對CB大鼠血清和肺組織中促炎細胞因子TNF-α、IL-1β含量的影響
　　 2.1金水

7、寶膠囊對CB大鼠血清和肺組織中TNF-α含量的影響
　　 結(jié)果顯示，與對照組（3.31±0.24，2.57±0.26）比較，模型組大鼠血清和肺組織中TNF-α含量（4.23±0.20，3.57±0.37）均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，高劑量組血清和肺組織中TNF-α含量（3.43±0.47，3.13±0.43）均明顯降低（P<0.05或P<0.01），桂龍組血清中TNF-α含量（3.69±0.21）也明顯降低（P<0

8、.05）；與低劑量組血清中TNF-α（3.91±0.50）比較，高劑量組含量也明顯降低（P<0.05）。見 Table1。
　　 2.2金水寶膠囊對CB大鼠血清和肺組織中IL-1β含量的影響
　　 結(jié)果顯示，與對照組（2.13±0.06，2.20±0.12）比較，模型組大鼠血清和肺組織中IL-1β含量（2.29±0.06，2.64±0.17）均明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，高劑量組（2.27±0.08，2.33

9、±0.12）和桂龍組（2.27±0.07，2.45±0.09）血清和肺組織中IL-1β含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），低劑量組肺組織中IL-1β含量也顯著低于模型組（P<0.01）。各治療組間比較，桂龍組血清和高劑量組肺組織中IL-1β含量較之低劑量組（2.29±0.07，2.48±0.08）顯著降低（P<0.01），高劑量組肺組織中IL-1β含量較之桂龍組亦顯著降低（P<0.05）。見 Table2。
　　 3.

10、金水寶膠囊對CB大鼠血清和肺組織中抗炎細胞因子IL-4、IL-10含量的影響
　　 3.1金水寶膠囊對CB大鼠血清和肺組織中IL-4含量的影響
　　 結(jié)果顯示，與對照組（123.21±23.15，1.15±0.02）比較，模型組大鼠血清和肺組織中IL-4含量（44.28±18.49，1.08±0.01）均明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，高劑量組（105.36±15.63，1.14±0.02）和桂龍組（83.50±

11、21.23，1.11±0.04）血清和肺組織中IL-4含量均顯著增加（P<0.05或P<0.01），低劑量組血清和肺組織中IL-4含量也明顯高于模型組（P<0.05）。各治療組間比較，高劑量組血清中和肺組織中IL-4含量較之低劑量組（66.23±32.07，1.11±0.03）明顯增加（P<0.05或P<0.01），對肺組織中IL-4含量的影響亦顯著高于桂龍組（P<0.05）。見 Table3。
　　 3.2金水寶膠囊對CB大鼠

12、血清和肺組織中IL-10含量的影響
　　 結(jié)果顯示，與對照組（25.63±2.97，8.06±0.65）比較，模型組大鼠血清和肺組織中IL-10含量（13.38±2.26，3.36±0.95）均明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，低劑量組（20.26±4.11，5.33±0.48）和桂龍組（19.88±3.72，6.04±1.39）血清和肺組織中IL-10含量均顯著增加（P<0.05），高劑量組肺組織中IL-10含量（6.3

13、8±0.79）也明顯高于模型組（P<0.01）。各治療組之間對血清和肺組織中IL-10含量的影響未見明顯差異（P>0.05）。見Table4。
　　 4.金水寶膠囊對CB大鼠肺組織cNOS表達的影響
　　 對照組大鼠細支氣管粘膜上皮細胞胞漿cNOS呈較強的陽性表達（Fig.7、8）；模型組大鼠可見細支氣管粘膜上皮細胞胞漿存在較弱的cNOS陽性反應(yīng)信號，動脈管壁平滑肌細胞胞漿呈較強陽性表達（Fig.9、10）。陽性信號均呈

14、棕黃色。
　　 低劑量組與桂龍組細支氣管粘膜上皮細胞胞漿呈現(xiàn)較弱的陽性反應(yīng)（Fig.11、12，15、16）；高劑量組cNOS表達呈現(xiàn)較強的陽性信號。與對照組相似，陽性反應(yīng)主要見于細支氣管粘膜上皮細胞胞漿（Fig.13、14）。
　　 結(jié)論：
　　 1.促炎細胞因子 TNF-α、IL-1β和抗炎細胞因子IL-4、IL-10自穩(wěn)失衡，是慢性支氣管炎發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)；
　　 2.檢測血清促炎細胞因子 TNF

15、-α、IL-1β及抗炎細胞因子IL-4、IL-10水平可以作為慢性支氣管炎臨床診斷及評價療效的重要依據(jù)；
　　 3.CB狀態(tài)下，cNOS在細支氣管粘膜上皮細胞的表達受到抑制，并使內(nèi)源性NO生成和釋放減少，從而促進支氣管收縮；
　　 4.金水寶膠囊可以通過抑制促炎細胞因子的分泌，并增強抗炎細胞因子的活性，來調(diào)節(jié)促炎、抗炎細胞因子的失衡狀態(tài)，恢復(fù)其自穩(wěn)機制；
　　 5.金水寶膠囊能有效調(diào)節(jié)肺組織中cNOS的表達，對C