促糖尿病潰瘍愈合細(xì)胞-材料三維復(fù)合物的研制及應(yīng)用基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：本研究以天然高分子水凝膠材料作為三維細(xì)胞支架負(fù)載轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞，該種子細(xì)胞可高效表達(dá)血小板衍化生長(zhǎng)因子（PDGF-BB）的中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），以構(gòu)筑細(xì)胞/材料三維復(fù)合物，并應(yīng)用于糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型以評(píng)價(jià)其促潰瘍愈合效果。 方法：應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將rhPDGF-BB基因通過載體轉(zhuǎn)入CHO細(xì)胞，經(jīng)Zeocin抗生素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，應(yīng)用細(xì)胞熒光及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linke

2、d immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量。選擇天然生物高分子材料殼聚糖經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸（n-acetyl-1-cysteinen，NAC）修飾后合成含321.4μmol/g巰基的雙硫鍵殼聚糖，加去離子水合成水凝膠，應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)排斥法及MTT法通過直接法評(píng)價(jià)水凝膠對(duì)轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞的生物相容性，將該水凝膠負(fù)載轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞/材料三維復(fù)合物，分別通過大體形態(tài)、顯微鏡以及掃描電子顯微鏡觀察細(xì)

3、胞/材料三維復(fù)合物中，水凝膠材料的孔隙大小及細(xì)胞分布情況。并應(yīng)用ELISA方法測(cè)定細(xì)胞/材料三維復(fù)合物培養(yǎng)基上清液中rhPDGF-BB的濃度檢測(cè)細(xì)胞/材料三維復(fù)合物PDGF釋放水平。 通過動(dòng)物的全身過敏實(shí)驗(yàn)、皮膚致敏實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)及經(jīng)靜脈亞急性毒理實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)該水凝膠材料生物相容性。應(yīng)用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)，制各糖尿病大鼠模型，并進(jìn)一步在模型動(dòng)物背部皮膚打孔制備糖尿病潰瘍模型，利用轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞/水凝膠材料三維復(fù)合物覆蓋

4、潰瘍表面，與單純水凝膠、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）凝膠及空白干預(yù)對(duì)照，通過計(jì)算潰瘍愈合率及分析創(chuàng)面修復(fù)病理變化評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞/水凝膠材料三維復(fù)合物促潰瘍愈合效果及免疫組化法評(píng)價(jià)肉芽組織PDGF表達(dá)情況。 結(jié)果：ELISA測(cè)定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞能夠高效表達(dá)PDGF，與殼聚糖水凝膠復(fù)合后，PDGF蛋白表達(dá)量無任何負(fù)性影響，以及臺(tái)盼藍(lán)排斥法及MTT法顯示該水凝膠材料生物相容性良好，將該水凝膠負(fù)載轉(zhuǎn)基因CHO細(xì)胞構(gòu)成細(xì)胞/材料三維復(fù)

5、合物，掃描電鏡顯示其成互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔徑比較均一，細(xì)胞黏附良好。應(yīng)用于糖尿病大鼠潰瘍模型后，通過與各組對(duì)照顯示安全性良好，對(duì)潰瘍愈合有顯著改善作用（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示各組在不同時(shí)間PDGF表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異（P>0.05）。 結(jié)論：含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的rhPDGF-BB真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得穩(wěn)定表達(dá)rhPDGF-BB蛋白的細(xì)胞系，并應(yīng)用天然生物高分子水凝膠材料制備成三維細(xì)胞支架以負(fù)載轉(zhuǎn)基因種子細(xì)胞構(gòu)