凍存活性微粒羊膜促糖尿病創(chuàng)面愈合的作用及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病足部潰瘍是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在糖尿病病程中大約有25％的病人會(huì)發(fā)生下肢潰瘍。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案主要包括清創(chuàng)、創(chuàng)面敷料覆蓋保濕、創(chuàng)面感染控制、血管再造和減壓治療。但即使予以這些標(biāo)準(zhǔn)化治療，糖尿病創(chuàng)面仍然愈合緩慢，大約7％-20％的病人最終需要截肢。現(xiàn)臨床急需新的治療手段加速糖尿病創(chuàng)面愈合，阻止足部潰瘍最終導(dǎo)致的截肢。
　　人羊膜來(lái)源于胎盤的最內(nèi)層，主要包括單層羊膜上皮細(xì)胞層、厚基底膜層以及無(wú)血管基質(zhì)層。早在20世紀(jì)初就有應(yīng)

2、用羊膜治療創(chuàng)面的臨床報(bào)道并取得了良好的效果。在過(guò)去的一百年中羊膜在創(chuàng)面愈合中的作用被許多文獻(xiàn)所證實(shí)，主要通過(guò)加速上皮化、減輕炎癥反應(yīng)、抑制瘢痕形成和抗菌等作用促進(jìn)創(chuàng)面愈合。近年來(lái)研究表明羊膜上皮細(xì)胞為多能干細(xì)胞，能向三個(gè)胚層細(xì)胞分化，且局部注射羊膜細(xì)胞浸提液及羊膜上皮細(xì)胞能加速急性創(chuàng)面的愈合。盡管此前眾多研究表明羊膜在創(chuàng)面修復(fù)中的巨大潛能，但仍然存在許多缺點(diǎn)限制了人羊膜臨床應(yīng)用潛能的最大化。首先，目前的保存方法（冷凍干燥法、伽馬射線滅菌

3、法以及甘油保存等）無(wú)法完整保存羊膜細(xì)胞活性，導(dǎo)致羊膜上皮細(xì)胞活性完全喪失或僅保存極低活性。其次，羊膜非常薄，機(jī)械強(qiáng)度低，目前臨床應(yīng)用大張羊膜覆蓋創(chuàng)面難以保證羊膜完全平整粘附到創(chuàng)面，羊膜很容易變干而與創(chuàng)面分離，僅能作為暫時(shí)的生物敷料短時(shí)間覆蓋創(chuàng)面。另外，羊膜上皮細(xì)胞在慢性創(chuàng)面中的治療作用及機(jī)制研究，以前未見報(bào)道。
　　目的：
　　在本課題中，我們臨床獲取胎盤廢棄新鮮羊膜并采用自制微粒皮切割機(jī)將其加工為300-600微米大小的微

4、粒化羊膜。在應(yīng)用商品化的無(wú)血清干細(xì)胞凍存液凍存微粒羊膜半年后，我們復(fù)蘇羊膜并檢測(cè)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及生物活性因子，隨后移植復(fù)蘇后的微粒羊膜修復(fù)糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，評(píng)估其治療有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究所采用的凍存方法能良好保存羊膜的天然結(jié)構(gòu)、細(xì)胞活性及生物活性因子。局部應(yīng)用凍存微粒羊膜能明顯促進(jìn)糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合，且移植后微粒羊膜中的羊膜上皮細(xì)胞能保持高移植潛能，在創(chuàng)面存活率高。隨后我們進(jìn)一步探究?jī)龃婊钚晕⒘Ｑ蚰ご龠M(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的

5、機(jī)制，主要通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)探討凍存活性微粒羊膜對(duì)糖尿病創(chuàng)面炎癥的調(diào)控和新生血管化的影響，以及羊膜基質(zhì)能否作為真皮替代物長(zhǎng)期存在于創(chuàng)面促進(jìn)真皮重構(gòu)。
　　方法：
　　1.采用自制微粒皮切割機(jī)將人新鮮羊膜制備為300-600微米大小微?；蚰ぃS后應(yīng)用無(wú)血清干細(xì)胞凍存液STEM-CELLBANKERTM凍存微粒羊膜半年，通過(guò)下面方法檢測(cè)凍存效果。
　　(1)H&E切片染色檢測(cè)復(fù)蘇后羊膜結(jié)構(gòu);
　　(2) live/

6、dead細(xì)胞活性試驗(yàn)檢測(cè)復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞活性;
　　(3)掃描電鏡觀察復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu);
　　(4)收集凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基，采用人生長(zhǎng)因子抗體芯片、人趨化因子抗體芯片及人炎癥因子抗體芯片分別檢測(cè)活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基中生長(zhǎng)因子、趨化因子及炎癥因子的表達(dá)情況。
　　2.將糖尿病小鼠分為三組:凍存活性微粒羊膜組、凍存去細(xì)胞微粒羊膜組和空白對(duì)照組。將凍存活性微粒羊膜移植于糖尿病小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面并通過(guò)檢測(cè)

7、以下指標(biāo)評(píng)估其修復(fù)效果。
　　(1)定期拍照觀察創(chuàng)面愈合大體形態(tài)并計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率;
　　(2)H&E染色觀察愈合創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)及羊膜在創(chuàng)面的降解情況;
　　(3)H&E染色及免疫組織化學(xué)染色抗人線粒體抗體觀察凍存活性微粒羊膜移植后羊膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)歸情況，TUNEL染色檢測(cè)人羊膜上皮細(xì)胞移植于創(chuàng)面后凋亡情況;
　　(4)免疫組織化學(xué)染色抗F4/80抗體觀察創(chuàng)面巨噬細(xì)胞數(shù)量，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)創(chuàng)面M1型及M2型巨

8、噬細(xì)胞比例。ELISA檢測(cè)創(chuàng)面促炎因子及創(chuàng)面愈合相關(guān)因子的表達(dá)情況;
　　(5)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凍存活性微粒羊膜移植后外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量，免疫組織化學(xué)染色抗CD34和CD31抗體分別檢測(cè)創(chuàng)面造血祖細(xì)胞及新生血管數(shù)量。
　　3.收集凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基，通過(guò)以下方法評(píng)估其對(duì)原代鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞功能的影響。
　　(1) CCK-8法檢測(cè)凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對(duì)原代鼠

9、骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞增殖能力的影響;
　　(2) Transwell小室測(cè)定凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對(duì)原代鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞遷移能力的影響;
　　(3)小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成小管能力的影響;
　　(4) IFN-γ和TNF-α刺激原代鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞為M1型巨噬細(xì)胞。通過(guò)顯微鏡觀察凍存活性

10、微粒羊膜條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞形態(tài)改變及PCR檢測(cè)M1型、M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)水平的變化來(lái)評(píng)估凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用。
　　結(jié)果：
　　1.凍存復(fù)蘇后微粒羊膜和新鮮微粒羊膜中羊膜上皮細(xì)胞的活性分別為73.08％±2.95％和92.94％±2.27％。H&E染色結(jié)果顯示復(fù)蘇后單層羊膜上皮細(xì)胞緊貼于厚基底膜層，與新鮮微粒化羊膜結(jié)構(gòu)類似。進(jìn)一步掃描電鏡結(jié)果顯示復(fù)蘇后羊膜上皮細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)保存完好，未見

11、膜孔洞形成。人生長(zhǎng)因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)AR，EGFR，CSF2，CSF3，HB-EGF, HGF, IGFBP-2，IGFBP-3，CSF1R，NT-3，PDGFR和TGF-β1。人趨化因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)GRO，IL-8，MCP-1和MIP-1b。人炎癥因子抗體芯片結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基高表達(dá)IL-6，IL-8，MCP-1，MIP-1b，TGF-β1，TNF-

12、β和TIMP-2。
　　2.1.凍存活性微粒羊膜移植后7天，創(chuàng)面濕而紅潤(rùn)，微粒羊膜存活良好。創(chuàng)面第21天凍存活性微粒羊膜組大部分創(chuàng)面完全愈合，平均創(chuàng)面愈合率為94.64％±2.67％，明顯高于凍存去細(xì)胞微粒羊膜組（80.52％±3.85％，p＜0.001）和空白對(duì)照組（68.40％±5.37％，p＜0.001）。凍存活性微粒羊膜組及凍存去細(xì)胞微粒羊膜組中羊膜微粒充填于真皮基質(zhì)，真皮厚度明顯高于空白對(duì)照組，2個(gè)月左右大部分羊膜微粒發(fā)

13、生降解。
　　2.2.創(chuàng)面第5天，羊膜上皮細(xì)胞在創(chuàng)面存活良好，大部分緊密貼附于羊膜基質(zhì)并顯示出復(fù)層生長(zhǎng)的趨勢(shì)，僅非常少量羊膜上皮細(xì)胞發(fā)生遷移。創(chuàng)面第7天少量羊膜上皮細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡，第28天時(shí)創(chuàng)面未檢測(cè)到人羊膜上皮細(xì)胞。
　　2.3創(chuàng)面第5天凍存活性微粒羊膜組創(chuàng)面F4/80陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)目明顯高于其他兩組，但第10天時(shí)明顯低于其他兩組且M1型巨噬細(xì)胞比例顯著低于其他兩組、M2型巨噬細(xì)胞比例顯著高于其他兩組。創(chuàng)面第10天凍存活

14、性微粒羊膜組創(chuàng)面促炎因子IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)顯著減少，而促創(chuàng)面愈合因子TGF-β1、IGF-1和VEGF表達(dá)顯著增高。
　　2.4創(chuàng)面第5天凍存活性微粒羊膜組外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量明顯高于其他兩組，且創(chuàng)面CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量也顯著增高。肉眼觀顯示創(chuàng)面第14天和21天凍存活性微粒羊膜組血管化明顯高于其他兩組，這一結(jié)果與免疫組化檢測(cè)創(chuàng)面新生血管數(shù)量結(jié)果一致。
　　3.IFN-γ+TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞伸出突起而凍存

15、活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞伸長(zhǎng)向M2型巨噬細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步PCR結(jié)果顯示凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基能上調(diào)CD206基因表達(dá)而下調(diào)CCR7基因表達(dá)。凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基可促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移而對(duì)其增殖無(wú)影響。同時(shí)，凍存活性微粒羊膜條件培養(yǎng)基促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人原代成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞遷移、增殖及增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外成小管能力。
　　結(jié)論：
　　1、人新鮮羊膜以微?；问讲⒉捎脽o(wú)血清凍存液STEM-CEL