蝶蛹金小峰寄生對寄主轉(zhuǎn)錄組的影響及三種毒蛋白分子特性分析.pdf

1、菜粉蝶為十字花科蔬菜重要的害蟲，其危害嚴(yán)重，蝶蛹金小蜂為菜粉蝶的蛹期優(yōu)勢寄生蜂(Hu，1983)。寄生蜂雌蜂將一種或多種寄生因子注入寄主體內(nèi)，用來抑制寄主免疫、調(diào)控寄主生長發(fā)育和營養(yǎng)代謝等生理活動。這些寄生因子包括，毒液、多分DNA病毒(PDVs)、類病毒顆粒，卵巢蛋白等(Pennacchio et al.，2006)。在不含有PDVs的寄生蜂中，毒液為抑制寄主免疫的關(guān)鍵因子(Asgari et al.，2011)。寄生蜂除了能夠抑制寄

2、主免疫外，還能夠通過影響寄主的神經(jīng)肽基因來間接影響寄主的發(fā)育(Shi et al.，2015)。前期研究表明，菜粉蝶蛹在注射蝶蛹金小蜂毒液30分鐘后其免疫反應(yīng)就能被抑制(Fang et al.，2010)。因此，本研究通過比較寄生1小時和未寄生的菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組，來探究寄生對寄主整體基因表達的影響。同時，對蝶蛹金小蜂的三個毒液蛋白的生理功能展開了研究。
　　1.通過比較分析寄生和非寄生的菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組，研究在寄生后的早期階段，寄主體

3、內(nèi)整體基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化，特別是免疫相關(guān)基因的變化。通過拼接菜粉蝶蛹轉(zhuǎn)錄組，得到了45，639個轉(zhuǎn)錄本和27，659個非冗余Unigenes。Unigene的平均長度為790bp。27，659個Unigenes中，共有18，377個Unigene被成功注釋。同時，還鑒定出557個差異表達基因，其中有21個為免疫相關(guān)基因。寄生導(dǎo)致大部分模式識別受體基因表達被下調(diào)，而絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達量被上調(diào)。本研究為蝶蛹金小蜂與其寄主菜粉蝶在分子

4、水平上的互作研究奠定了理論基礎(chǔ)。
　　2.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在生物體內(nèi)廣泛存在，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶通常參與谷胱甘肽的代謝，在抗氧化、解毒和炎癥過程中起關(guān)鍵作用。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)了一個可能編碼γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白(PpGGT)的基因序列。通過比較毒腺和殘體（不含毒腺）的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)PpGGT在毒腺中高表達。通過RACE技術(shù)，克隆得到了PpGGT的基因序列。序列分析表明，編碼PpGGT的cDNA序列全長2274

5、bp，ORF長1959bp，共編碼652個氨基酸殘基。采用Editseq軟件包對PpGGT基因序列進行預(yù)測，其理論分子量大小為72.196kDa，等電點為8.25。多序列比對顯示，PpGGT的成熟肽由大小兩個亞基組成。定量PCR、Western blot和免疫組化結(jié)果表明，PpGGT在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達，在其它組織中，幾乎檢測不到。PpGGT在羽化后1到6天的毒器官中都有表達，第六天表達量最高。在毒液和重組表達的PpGGT中，都能

6、夠檢測到GGT的活力。推測PpGGT能夠通過影響寄主體內(nèi)的谷胱甘肽代謝平衡，從而誘導(dǎo)血細(xì)胞的凋亡。
　　3.幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白存在于多種生物中，并參與多種重要的生理活動。我們通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(PpCBP)基因的部分序列。通過RACE技術(shù)，克隆得到PpCBP的全長cDNA序列。PpCBP基因能夠編碼96個氨基酸，包括一個分泌信號肽和一個Peritrophin-A domain。進化樹分析顯示Pp

7、CBP的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域與麗蠅蛹集金小蜂的幾丁質(zhì)結(jié)合功能域以及墨吉對蝦卵巢膜聚為一類。定量PCR、Western blot和免疫組織定位結(jié)果顯示，PpCBP在蝶蛹金小蜂毒器官中高表達。時間動態(tài)分析表明，PpCBP在蝶蛹金小蜂羽化后第4天的毒器官中表達量最高。結(jié)合測定結(jié)果表明，重組PpCBP能夠與幾丁質(zhì)相結(jié)合，而不能與纖維素相結(jié)合。蝶蛹金小蜂毒囊中含有幾丁質(zhì)，因此推測PpCBP為毒囊的組成成分，并保護毒囊免受毒腺中活性組分的傷害。

8、　　4.絲氨酸蛋白酶同源物參與昆蟲的多種生理活動。通過分析蝶蛹金小蜂毒腺轉(zhuǎn)錄組，我們發(fā)現(xiàn)了蝶蛹金小蜂絲氨酸蛋白酶同源物(PpSPH29)的部分序列。通過比較毒腺和殘體（不含毒腺）的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)PpSPH29在毒腺中高表達。通過RACE技術(shù)，從蝶蛹金小蜂毒腺中克隆獲得了PpSPH29的cDNA全長序列。PpSPH29基因全長1065bp，共編碼270個氨基酸。通過Editseq預(yù)測顯示，PpSPH29的等電點為4.4，分子量大小為29.4