蝶蛹金小蜂毒液分子特性及其調(diào)控寄主分子機(jī)理的研究.pdf

1、寄生蜂攜帶毒液、多分DNA病毒、類病毒顆粒、畸形細(xì)胞等寄生因子，以抑制寄主細(xì)胞或體液免疫，以及調(diào)控寄主生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)保證其后代在寄主體內(nèi)或體外成功發(fā)育。這些寄生因子因具有特殊的生理功能，若能結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)，以這些活性物質(zhì)為資源研制新型生防制劑或轉(zhuǎn)基因作物，將為害蟲(chóng)生物防治開(kāi)辟新的途徑。為此，寄生蜂與寄主相互作用關(guān)系的研究一直以來(lái)是昆蟲(chóng)生理生化和生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。這些研究旨在揭示寄生蜂寄生因子的本質(zhì)及其調(diào)控寄主的機(jī)制，為這些資源的利用

2、奠定基礎(chǔ)。目前，對(duì)多分DNA病毒和類病毒顆粒生化與分子特性的研究已相當(dāng)多，如近10種寄生蜂攜帶的多分DNA病毒已得到全基因組測(cè)序，從中獲得了眾多基因資源。然而，就毒液而言，現(xiàn)僅有為數(shù)不多的組分被鑒定。在寄生蜂調(diào)控寄主的機(jī)制方面，很大程度上僅是生理生化層面的研究，很少有寄生蜂調(diào)控寄主分子機(jī)制的研究。此外，在寄生蜂與寄主相互作用關(guān)系的研究中，涉及的寄生蜂主要限于繭蜂科Braconidae和姬蜂科Ichneumonidae，且多限于卵-幼蟲(chóng)期

3、或幼蟲(chóng)期寄生蜂。 有鑒于此，本研究以菜粉蝶Pierisrapae(鱗翅目Lepidoptera:粉蝶科Pieridae)的蛹期優(yōu)勢(shì)內(nèi)寄生蜂蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum(膜翅目Hymenoptera：金小蜂科Pteromalidae)(僅攜帶毒液一種寄生因子)為研究對(duì)象，在本實(shí)驗(yàn)室對(duì)蝶蛹金小蜂毒液生化特性及其調(diào)控寄主生理生化機(jī)制有過(guò)較詳細(xì)研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了蝶蛹金小蜂毒液分子特性及其調(diào)控寄主分子機(jī)理的研究。

4、 1蝶蛹金小蜂毒液分子特性 (1)蝶蛹金小蜂毒器官形態(tài)結(jié)構(gòu)。 (2)蝶蛹金小蜂毒液蛋白質(zhì)組學(xué)分析. (3)蝶蛹金小蜂毒器官cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及EST序列分析。 (4)蝶蛹金小蜂毒液鈣網(wǎng)蛋白基因的克隆及分析。 (5)蝶蛹金小蜂毒液對(duì)寄主菜粉蝶內(nèi)分泌激素的影響。 (6)蝶蛹金小蜂毒液酸性磷酸酶基因的克隆及分析 (7)蝶蛹金小蜂毒液堿性磷酸酶基因的克隆及分析 2蝶蛹金小蜂調(diào)控寄主

5、菜粉蝶的分子機(jī)理 (1)蝶蛹金小蜂寄生對(duì)菜粉蝶血漿蛋白質(zhì)組分的影響.通過(guò)雙向電泳研究發(fā)現(xiàn)，菜粉蝶蛹被蝶蛹金小蜂寄生24h后，其血漿中7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生了差異表達(dá)，這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定，為類似絲氨酸蛋白酶同源蛋白、烯醇化酶、成蟲(chóng)盤(pán)生長(zhǎng)因子、膽素結(jié)合蛋白、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、維甲酸結(jié)合蛋白以及一未知功能蛋白，它們?yōu)榕c免疫、細(xì)胞骨架、解毒和能量代謝相關(guān)蛋白。依據(jù)質(zhì)譜獲得的肽段序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，并結(jié)合RACE技術(shù)，克隆獲得了類似絲氨酸蛋

6、白酶同源蛋白、烯醇化酶和膽素結(jié)合蛋白的全長(zhǎng)基因。RT-PCR分析表明，蝶蛹金小蜂寄生能導(dǎo)致菜粉蝶類似絲氨酸蛋白酶同源蛋白和膽素結(jié)合蛋白基因在蛹脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平升高，而對(duì)烯醇化酶和成蟲(chóng)盤(pán)生長(zhǎng)因子蛹脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平無(wú)影響。 (2)蝶蛹金小蜂寄生對(duì)菜粉蝶貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？寺×瞬朔鄣A藏蛋白基因，并研究了蝶蛹金小蜂寄生對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響。菜粉蝶貯藏蛋白基因全長(zhǎng)為2270bp，ORF為2121bp，編碼707aa，預(yù)測(cè)分子量約

7、83kDa，p16.13。推導(dǎo)的氨基酸序列中有一16aa的信號(hào)肽，2個(gè)保守的貯藏蛋白家族結(jié)構(gòu)域。分子進(jìn)化分析表明，克隆到的菜粉蝶貯藏蛋白基因?qū)俜蓟A藏蛋白。依據(jù)氨基酸組成，克隆到的菜粉蝶貯藏蛋白甲硫氨酸和芳香族氨基酸的含量分別為1.42％和18.82％，屬芳基貯藏蛋白的范圍。RT-PCR分析表明，蝶蛹金小蜂寄生能引起菜粉蝶芳基貯藏蛋白基因在蛹脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平升高。 (3)蝶蛹金小蜂寄生對(duì)菜粉蝶鈣網(wǎng)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。克隆了菜粉

8、蝶鈣網(wǎng)蛋白基因，并研究了蝶蛹金小蜂寄生對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響。菜粉蝶鈣網(wǎng)蛋白基因全長(zhǎng)1816bp，ORF為1194bp，編碼398aa，預(yù)測(cè)分子量為45.75kDa，pI4.4。推導(dǎo)的氨基酸序列，可分為N、P、C3個(gè)區(qū)域，3個(gè)區(qū)域的特性與其它物種鈣網(wǎng)蛋白相似，與意大利蜜蜂、岡比亞按蚊Anophelesgambiae和黑腹果蠅的相似性分別為74％、70％和69％。RT-PCR分析表明，蝶蛹金蜂寄生能抑制鈣網(wǎng)蛋白基因在菜粉蝶蛹血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平

9、。 (4)蝶蛹金小蜂寄生對(duì)菜粉蝶血細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控?？寺×瞬朔鄣?dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白解聚因子及微管蛋白基因，并研究了蝶蛹金小蜂寄生對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的影響。菜粉蝶肌動(dòng)蛋白基因ORF為1131bp，編碼377aa，預(yù)測(cè)分子量為41.78kDa，pI為5.29，與其它昆蟲(chóng)肌動(dòng)蛋白的相似性非常高，在90％以上。氨基酸組成特點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，克隆到的菜粉蝶肌動(dòng)蛋白基因?qū)偌?xì)胞質(zhì)型肌動(dòng)蛋白。菜粉蝶肌動(dòng)蛋白解聚因子基因全長(zhǎng)為1243

10、bp，ORF為447bp，編碼149aa，預(yù)測(cè)分子量為16.97kDa，pI為7.11，與家蠶Bombyxmori、赤擬谷盜、意大利蜜蜂和桑粉介殼蟲(chóng)Maconellicoccushirsutus肌動(dòng)蛋白解聚因子的相似性分別為97％、87％、89％和72％。菜粉蝶微管蛋白基因全長(zhǎng)為1757bp，ORF為1344bp，編碼448aa，預(yù)測(cè)分子量為50.38kDa，pI為4.86，與家蠶β型微管蛋白1、2、3和4的相似性分別為97％、97％、

11、87％和93％。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，克隆到的菜粉蝶微管蛋白基因?qū)佴滦臀⒐艿鞍?。RT-PCR分析表明，蝶蛹金蜂寄生能抑制肌動(dòng)蛋白、肌動(dòng)蛋白解聚因子及微管蛋白基因在菜粉蝶蛹血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。 (5)蝶蛹金小蜂毒液對(duì)寄主菜粉蝶內(nèi)分泌激素的影響。結(jié)合寄生和毒液離體注射的方法，以未寄生和注射PBS為對(duì)照，測(cè)定菜粉蝶蛹血淋巴內(nèi)保幼激素滴度、保幼激素酯酶活性和蛻皮激素滴度在處理后72h內(nèi)的變化。結(jié)果顯示，寄生或注射毒液寄主蛹血淋巴的保幼激素(

12、僅檢測(cè)到III型)滴度在24-72h內(nèi)顯著高于對(duì)照組，且在處理12h后保幼激素滴度激急上升；保幼激素酯酶活性在未寄生或注射PBS的蛹血淋巴中分別于6-48h和12-36h顯著高于處理組，且其活性分別在12h和24h達(dá)到最大值；與處理組相比，蛻皮激素滴度在未寄生或注射PBS的蛹血淋巴中，12-36h之間快速上升，在36h達(dá)到峰值，然后下降，但48h以前其滴度均高于處理組，并在24-48h與處理組呈顯著差異。研究結(jié)果表明，蝶蛹金小蜂毒液能夠

13、擾亂其寄主菜粉蝶蛹的激素分泌系統(tǒng)。 (6)蝶蛹金小蜂寄生對(duì)柑桔鳳蝶血漿蛋白質(zhì)組分的影響。通過(guò)雙向電泳研究發(fā)現(xiàn)，柑桔鳳蝶蛹被蝶蛹金小蜂寄生24h后，其血漿中有16個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)發(fā)生了差異表達(dá)。其中8個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào)，5個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下降，1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)消失，2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)新出現(xiàn)。這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)質(zhì)譜鑒定，為與細(xì)胞或體液免疫、解毒及能量代謝相關(guān)的蛋白。 通過(guò)較系統(tǒng)的研究，本論文取得了下列創(chuàng)新性成果：明確了蝶蛹金小蜂毒器官的顯

14、微和超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，鑒定出蛹期或金小蜂科寄生蜂毒液中有鈣網(wǎng)蛋白、精氨酸激酶、絲氨酸蛋白酶、熱激蛋白70、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶等組分，克隆了鈣網(wǎng)蛋白精氨酸激酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶等4個(gè)毒液蛋白基因，并明確了酸性和堿性磷酸酶基因的組織定位、生化特性和表達(dá)時(shí)相；在寄生蜂毒器官中發(fā)現(xiàn)了1種致病性微小RNA新病毒；發(fā)現(xiàn)以毒液為單一寄生因子的寄生蜂寄生能引起寄主免疫、解毒和能量代謝的相關(guān)蛋白差異表達(dá)，其中與營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)的芳基貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水