單次小劑量環(huán)磷酰胺對CD4+CD25+Treg細胞影響的實驗研究.pdf

1、調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg細胞)占CD4+T細胞總數(shù)的5﹪-10﹪左右，在其構成中固定表達CD25。CD4+CD25+Treg細胞在控制針對自身抗原的免疫耐受中起著重要的作用，表現(xiàn)出了其在防止自身免疫性疾病方面的重要性。因為腫瘤相關抗原也是由自身抗原發(fā)展而來，這也就提示我們CD4+CD25+Treg細胞在幫助腫瘤逃避自身抗體的攻擊方面也許發(fā)揮著一定的作用。有證據(jù)顯示發(fā)展較快的腫瘤往往伴有CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量的

2、急劇增加。在動物模型中我們也發(fā)現(xiàn)移除CD4+CD25+Treg細胞有助于增強腫瘤免疫。 現(xiàn)在已經知道，環(huán)磷酰胺除了作為烷化劑所表現(xiàn)出來的直接性的細胞毒作用以外，還同時具有免疫調節(jié)方面的功能，比如它可以清除CD4+CD25+Treg細胞。在這方面，國際上研究得較多的便是小劑量環(huán)磷酰胺的作用劑量及藥效的持續(xù)時間。有研究發(fā)現(xiàn)，使用小劑量環(huán)磷酰后，第4d其作用強度達到最大值，CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量又顯著降低，僅為正常值的50

3、﹪左右。而在第10d環(huán)磷酰胺的作用基本消失，CD4+CD25+Treg細胞數(shù)量也基本恢復到原來水平。 以上便是有關于環(huán)磷酰胺與CD4+CD25+Treg細胞的研究現(xiàn)狀，本次實驗便是基于上述理論所設計的，主要從動物實驗方面進行驗證。本次實驗的目的即為了探討單次小劑量注射常規(guī)化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide CY)對于小鼠調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg細胞)的影響，同時研究其在腫瘤預防方面的作用。

4、 材料和方法 實驗分為兩大部分：A單純注射小劑量環(huán)磷酰胺的CY組小鼠及僅注射生理鹽水的對照組小鼠。在環(huán)磷酰胺注射后的第4d，用Western blotting技術檢測scurfin蛋白在兩組小鼠脾臟中的表達；用流式細胞術檢測兩組小鼠脾臟中CD4+CD25+Treg細胞表達的百分比并進行比較。B注射完環(huán)磷酰胺24h后接種腫瘤的CY+腫瘤組及注射完生理鹽水24h后接種腫瘤的生理鹽水+腫瘤組。在實驗過程中，每日觀察小鼠飲食、活動及一

5、般狀況。連續(xù)測量腫瘤體積和小鼠體重，分別繪制腫瘤生長曲線和小鼠體重變化曲線，觀察CY+腫瘤組的抑瘤效果并與生理鹽水+腫瘤組進行比較。接種后20d兩組全部小鼠處死，稱量瘤重，取其脾臟淋巴細胞，用MTT法檢測刀豆蛋白A(conA)誘導的淋巴細胞增殖情況并進行對比。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。 結果 1．根據(jù)流式結果統(tǒng)計，CY組CD4+CD25+Treg細胞相對數(shù)量為(1．651±0．427)﹪，對照

6、組的值為(1．280±0．447)﹪，兩組之間有統(tǒng)計學意義。說明CY組與對照組相比，其CD4+CD25+Treg細胞的百分比有所降低。 2．根據(jù)Western blotting結果分析，設對照組的譜帶強度值為1，則CY組的值為0．74±0.043，兩者之間有統(tǒng)計學意義。說明CY組與對照組相比，其scurfin蛋白的表達量有所降低。 3．生理鹽水+腫瘤組腫瘤生長曲線較為陡直；CY+腫瘤組腫瘤生長曲線比較平緩，且出瘤時間延

7、緩。 4．CY+腫瘤組小鼠體重變化不明顯，且小鼠的一般狀況較好：生理鹽水+腫瘤組小鼠體重逐漸增加，后期體重負荷較大，體重下降。 5．CY+腫瘤組小鼠脾細胞的增殖能力相對增高。 結論 1．單次低劑量環(huán)磷酰胺能有效降低正常小鼠體內調節(jié)性T細胞的相對數(shù)量。 2．單次低劑量環(huán)磷酰胺能有效降低正常小鼠體內scurfin蛋白的表達量。 3．單次低劑量環(huán)磷酰胺的預先作用能夠有效地抑制小鼠RMA淋巴瘤的生