靜脈注射與口服抗原誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg源外泌體對(duì)移植腎存活的影響.pdf

1、目的：
　　慢性排斥反應(yīng)是導(dǎo)致移植器官功能喪失的最主要原因[1-7]。過去的40年內(nèi)，隨著免疫抑制劑的不斷發(fā)展及有效應(yīng)用，在保障移植器官長(zhǎng)期存活以及維護(hù)良好器官功能方面取得了巨大成功[8-12]。然而，由于藥物本身特性導(dǎo)致的各種毒性反應(yīng)，如:胃腸道不良反應(yīng)、糖尿病、各型感染以及腫瘤的發(fā)生，長(zhǎng)期困擾臨床治療[13-17]。如何規(guī)避藥物毒性實(shí)現(xiàn)免疫抑制是當(dāng)前移植免疫學(xué)中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。
　　口服免疫耐受(oral tol

2、erance)是通過口服可溶性抗原，如食物抗原，腸道微生物等，可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)該種抗原蛋白形成無反應(yīng)或低反應(yīng)的免疫耐受狀態(tài)[18-21]。因其獨(dú)特的理念及低毒性使其目前備受關(guān)注[22-24]?？诜庖吣褪軝C(jī)制目前尚不清楚，主流認(rèn)為是口服抗原在腸道誘導(dǎo)了抗原特異性的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)[25-26]，后者通過有效抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化與增殖，實(shí)現(xiàn)對(duì)該抗原的系統(tǒng)免疫主動(dòng)抑制反應(yīng)，然而具體機(jī)

3、制有待進(jìn)一步研究證實(shí)[27-30]。
　　外泌體(exosomes)是多種細(xì)胞分泌的一種囊泡結(jié)構(gòu)，其通過呈遞表面抗原，激活多種細(xì)胞免疫因子，介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，在免疫監(jiān)視、免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[31-37]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn):外源性給予CD4+CD25+Treg細(xì)胞可延長(zhǎng)移植腎存活時(shí)間。通過口服抗原，獲取了特異性CD4+CD25+Treg源性外泌體，并初步探討了CD4+CD25+Treg源性外泌體在大鼠腎移植中的保護(hù)作用。

4、在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過靜脈注射與口服抗原途徑，誘導(dǎo)免疫耐受，觀察兩種途徑獲取的CD4+CD25+Treg源性外泌體對(duì)大鼠移植腎存活的影響。通過體外淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)、SDS-PAGE、WB實(shí)驗(yàn)明確外泌體在排斥反應(yīng)中起到的作用。
　　材料與方法：
　　1.抗原的制備:在相關(guān)網(wǎng)站用特定的檢索方式網(wǎng)站查詢到RDP58(humanleukocyte antigen HLA衍生肽的一種)肽氨基酸序列，首先合成RDP58肽段，然后合成RD

5、P58衍生肽段，交聯(lián)RDP58衍生肽與霍亂毒素，之后用高效液相色譜法純化、檢測(cè)交聯(lián)產(chǎn)物，即抗原。
　　2.選擇6-8周齡劉易斯大鼠作為受體，分別通過靜脈注射與口服制備好的抗原誘導(dǎo)免疫耐受，并誘導(dǎo)特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生，之后選擇6-8周齡挪威大鼠作為受體建立起大鼠腎移植模型，觀察受體大鼠的血肌酐，尿素氮以及移植腎的病理?yè)p害情況。
　　3.CD4+CD25+Treg細(xì)胞源外泌體的制備:選擇6-8周齡劉易斯大鼠作

6、為受體，分別通過靜脈注射與口服制備好的抗原，誘導(dǎo)特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞產(chǎn)生，收集腸系膜淋巴結(jié)，通過流式細(xì)胞儀分選淋巴結(jié)中的CD4+CD25+Treg細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)10天，收集其細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用差速離心法收集上清中的外泌體，并用電鏡觀察鑒定，后冰凍存于-80度冰箱備用。
　　4.外泌體對(duì)腎臟的保護(hù)作用觀察:建立大鼠腎移植模型，通過尾靜脈將制備好的外泌體注射入受體大鼠，觀察受體大鼠的血肌酐，尿素氮以及移植腎的病理?yè)p害

7、情況。
　　5.用SDS-PAGE，Western Blot法檢測(cè)外泌體與免疫抑制相關(guān)蛋白種類，以及不同途徑誘導(dǎo)的外泌體在對(duì)移植物保護(hù)的比較。
　　結(jié)果:
　　1.通過RDP58衍生肽與霍亂毒素交聯(lián)產(chǎn)物能有效誘導(dǎo)口服耐受產(chǎn)生。
　　2.通過SDP-PAGE和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg源外泌體攜帶有白介素-10、TGF-β等細(xì)胞因子，與其發(fā)揮免疫抑制作用有關(guān)。外泌體是CD4+CD2

8、5+Treg發(fā)揮遠(yuǎn)端調(diào)控，抑制免疫排斥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。
　　3.口服RDP58-GC-CTB抗原產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg源外泌體與靜脈注射抗原產(chǎn)生的CD4+CD25+Treg源外泌體都能對(duì)移植腎產(chǎn)生保護(hù)作用，但口服途徑產(chǎn)生的外泌體，對(duì)移植腎的保護(hù)功能更強(qiáng)，更加安全便捷。
　　結(jié)論:
　　RDP58-GC-CTB是一種良好的抗原，能有效誘導(dǎo)免疫耐受;CD4+CD25+Treg來源的外泌體攜帶的免疫抑制性蛋白，