多色引物原位標(biāo)記技術(shù)快速檢測人類精子染色體數(shù)目異常.pdf

1、目的：染色體數(shù)目異常是人類染色體疾病的重要類型，經(jīng)常導(dǎo)致胚胎丟失、胎兒流產(chǎn)、嬰兒死亡、先天畸形和神經(jīng)發(fā)育異常等出生缺陷。引物原位標(biāo)記技術(shù)同時結(jié)合了FISH和PCR技術(shù)的優(yōu)勢，已經(jīng)成為替代FISH的一項技術(shù)用于染色體數(shù)目異常的檢測。自引物原位標(biāo)記技術(shù)廣泛引入人類基因組研究和臨床染色體檢查以來，特異染色體引物的設(shè)計和評估主要基于特定染色體alpha衛(wèi)星重復(fù)序列單元的克隆信息。至2001年，人類基因圖譜的繪制完成，人們可以方便的在互聯(lián)網(wǎng)上任意

2、調(diào)取人類的全基因組序列，并通過新的計算機(jī)一互聯(lián)網(wǎng)工具，快速準(zhǔn)確地分析DNA序列和比對整個基因組序列，設(shè)計和驗證引物。今天人們可以用更新更完整的基因組信息和技術(shù)回顧傳統(tǒng)的引物序列，對其有效性和可靠性進(jìn)行重新的評估。本文試圖用新的基因組工具檢驗和完善非ddNTP阻斷的多色引物原位標(biāo)記技術(shù)，探索一種更為合理的多色PRINS系統(tǒng)程序，并針對精子染色體異倍性的研究進(jìn)行可靠性分析。 方法：首先我們將傳統(tǒng)引物都與最新的人類基因組信息進(jìn)行了比對

3、。BLAST比對結(jié)果在大多數(shù)情況下驗證了這些經(jīng)典引物的退火有效性。隨后在人類外周血淋巴細(xì)胞中建立了一個穩(wěn)定的多色PRINS標(biāo)記方法并評估其標(biāo)記效率。通過雙色PRINS預(yù)實驗，分析不同的靶標(biāo)序列和熒光色素的標(biāo)記特點以確定PRINS標(biāo)記順序；隨后，采用非ddNTP阻斷的三色PRINS方法，對外周血中期淋巴細(xì)胞的18號，21號，X和Y染色體構(gòu)建了更為穩(wěn)定的多色標(biāo)記體系。同時，一個克氏綜合征(47，XXY)的特殊外周血樣本用來證明信號與染色體的

4、數(shù)目匹配性，評估多色PRINS方法應(yīng)用于染色體數(shù)目異?？焖僭\斷的可行性。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，PRINS技術(shù)應(yīng)該比FISH更適于精子核的標(biāo)記。本文精子實驗中，在PRINS反應(yīng)之前，我們采用3M NaOH溶液進(jìn)行4-5分鐘的預(yù)處理，以達(dá)到對精子核同時去濃縮和變性的目的。在單色精子PRINS預(yù)實驗和雙色淋巴細(xì)胞PRINS預(yù)實驗的指導(dǎo)下，引物的使用條件(包括濃度和溫度等)以及靶標(biāo)--dUTP--熒光色素的標(biāo)記組合使用順序得到了優(yōu)化，最終在外周血淋巴細(xì)

5、胞獲得了均一的多色熒光標(biāo)記信號，反應(yīng)時間限制在3.5個小時內(nèi)。我們對2份正常男性精液標(biāo)本的4條染色體(含18號，21號兩條常染色體和X，Y兩條性染色體)進(jìn)行了分析。 結(jié)果：成功地在2.5小時內(nèi)標(biāo)記了同一精子核內(nèi)的多條染色體，最佳的染色體同時標(biāo)記通量為3條，單色以上標(biāo)記率達(dá)到99％。對每條染色體的評估都至少分析5000個精子核(性染色體則更多)。精子染色體中常染色體的平均二體率為18號染色體的O.125％到21號染色體的0.152

6、％，性染色體的平均二體率為XX二體的0.085％到XY二染色體的0.102％。與外周血淋巴細(xì)胞二色PRINS的檢測結(jié)果類似，21號染色體的二體率比其他染色體略高。盡管從結(jié)果來看常染色體的二體率比性染色體稍高，但沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。二倍體率則由0.035％到0.083％浮動，也沒有統(tǒng)計得到顯著的異質(zhì)性(P<0.05)。同時在實驗中觀察到二體率比二倍率要高的情況，這可能意味著在精子形成的減數(shù)分裂過程中，二體更易(或有更多的機(jī)會)形成。