骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景： 骨質(zhì)疏松性骨折的治療包括外科干預(yù)、積極應(yīng)用抗骨質(zhì)疏松性藥物、功能鍛煉等。其中對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折患者進(jìn)行外科干預(yù)、以及在術(shù)后開展功能鍛煉的技術(shù)與觀點(diǎn)比較一致，但是對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折患者如何使用抗骨質(zhì)疏松藥物、何時(shí)使用和使用何種類型的抗骨質(zhì)疏松藥物尚沒有形成一致意見，也缺乏詳細(xì)的研究。阿倫膦酸鈉和1，25(OH)2D3作為臨床上使用最為廣泛的兩種治療骨質(zhì)疏松的藥物，分別作為骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑的代表，已經(jīng)在眾多的骨質(zhì)疏松患

2、者中廣泛使用。觀察其對(duì)于骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響，特別是進(jìn)行圍骨折期用藥選擇的實(shí)驗(yàn)研究，對(duì)于指導(dǎo)骨質(zhì)疏松性骨折患者如何用藥具有很大的臨床實(shí)際意義。 目的： 利用雌性去勢大鼠骨質(zhì)疏松模型，探討圍骨質(zhì)疏松性骨折期使用骨吸收抑制劑(阿倫磷酸鈉)對(duì)骨折愈合的影響，并闡明其作用的分子生物學(xué)機(jī)制。同時(shí)評(píng)價(jià)骨形成促進(jìn)劑(1，25(OH)2D3)對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的影響。 方法： 根據(jù)研究目的，本研究分為三個(gè)部分。

3、 1.骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)取自9月齡去勢SD大鼠，分別暴露于0.01、0.1、1、10μmol/L阿倫瞵酸鈉。在成骨誘導(dǎo)和成脂誘導(dǎo)條件下，2周后進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色和定量分析、油紅O染色和鏡下計(jì)數(shù)分析，同時(shí)使用RT-PCR檢測特異標(biāo)志基因的表達(dá)。使用MAPK通路特異性抑制劑并誘導(dǎo)2周后，再觀察標(biāo)志基因的表達(dá)情況。Westernblot觀察藥物對(duì)MAPK表達(dá)的影響。 2.60只雌性SD大鼠隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組

4、(Saline/Saline)、骨折前用藥組(Aln/Saline)、骨折后用藥組(Saline/Aln)和持續(xù)用藥組(Aln/Aln)。阿倫膦酸鈉溶于生理鹽水中，灌胃服用，劑量為3mg/kg/day。對(duì)照組使用等量的生理鹽水。每周稱量大鼠體重，并根據(jù)體重變化進(jìn)行藥品劑量調(diào)整。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)入研究時(shí)均進(jìn)行去勢手術(shù)，三個(gè)月后再制備骨折模型。骨折后6周、16周收取骨折標(biāo)本，進(jìn)行X線攝片、micro-CT掃描分析、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)觀察。

5、 3.40只雌性SD大鼠隨機(jī)分為2組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在進(jìn)入研究時(shí)均進(jìn)行去勢手術(shù)，三個(gè)月后再制備骨折模型。1，25(OH)2D3溶于中鏈甘油三酯中，口服劑量為0.1microg/kg/day，對(duì)照組服用等量的中鏈甘油三酯。骨折后6周、16周收取骨折標(biāo)本，進(jìn)行X線攝片、micro-CT掃描分析、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)觀察。 結(jié)果： 1.BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)2周后，阿倫膦酸鈉組ALP染色面積明顯增大，定量分

6、析顯示ALP活性增高1～2倍(p＜0.001)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、Runx2、骨橋蛋白和骨涎蛋白的表達(dá)隨著藥物濃度的增高而逐漸增強(qiáng)，其效應(yīng)具有濃度依賴性(p＜0.001)。BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后，油紅O染色陽性細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增高而逐漸減少(p＜0.001)。PPARγ2的表達(dá)隨著藥物濃度的增高而逐漸降低。分別使用ERK1/2、JNK抑制劑PD98059和SP600125并誘導(dǎo)2周后，BMP-2、Runx2表達(dá)下調(diào)而PPARγ

7、2表達(dá)上調(diào)。使用p38抑制劑SB203580并誘導(dǎo)2周后，BMP-2、Runx2表達(dá)無明顯變化而PPARγ2表達(dá)下調(diào)。Westernblot顯示：阿倫膦酸鈉在5、15、30min時(shí)上調(diào)p-ERK1/2和p-JNK表達(dá)，分別使用抑制劑后，其表達(dá)下調(diào)。 2.骨折后6周，與對(duì)照組比較，使用阿倫膦酸鈉組的骨折線更加模糊，骨痂明顯增大。micro-CT的重建圖像進(jìn)一步證實(shí)了該結(jié)果，形態(tài)計(jì)量分析顯示：使用阿倫膦酸鈉組的TV、BV、BV/TV

8、、Tb.Th和表觀骨密度均較對(duì)照組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)顯示：各組間骨痂的最大載荷和吸收能量均高于對(duì)照組，以聯(lián)合組最大。HE染色示：使用阿倫磷酸鈉后，骨痂組織為大量幼稚的軟骨組織，而對(duì)照組軟骨性骨痂較多，部分轉(zhuǎn)換為骨性組織。骨折后16周，X線示各組骨折線均消失，使用阿倫磷酸鈉組的骨痂較6周時(shí)縮小，但仍大于對(duì)照組。micro-CT示對(duì)照組骨折處連接良好，基本完成骨重建過程，而使用阿倫磷酸鈉組的骨痂改建延緩

9、，骨折處有大量不成熟編織骨組織?；趍icro-CT的形態(tài)計(jì)量分析顯示TV、BV、BV/TV、Tb.Th和表觀骨密度均較對(duì)照組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)示各組間的最大載荷和吸收能量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)。HE染色示對(duì)照組骨折斷端間達(dá)到骨性連接，而使用阿倫膦酸鈉組的骨折斷端間由排列不規(guī)則的大量編織骨相連。 3.骨折后6周，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組骨折線更加模糊。micro-CT示實(shí)驗(yàn)組骨折斷端間

10、有骨性骨痂連接，骨痂輕微增大；形態(tài)計(jì)量分析示TV、BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N和表觀骨密度均較對(duì)照組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。實(shí)驗(yàn)組最大載荷和吸收能量均顯著大于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組骨折處形成較多編織骨樣組織，而對(duì)照組形成較多軟骨樣骨痂組織。骨折后16周，兩組骨折線均消失。micro-CT示實(shí)驗(yàn)組骨痂改建良好，基本達(dá)到完全骨性連接，形態(tài)計(jì)量分析顯示Tb.Th、Tb.N

11、和表觀骨密度均較對(duì)照組增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)示實(shí)驗(yàn)組最大載荷和吸收能量均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。HE染色示實(shí)驗(yàn)組骨折愈合良好，骨折處為排列一致的板層骨，而對(duì)照組有少量排列不規(guī)則的骨組織。 結(jié)論： 1.阿倫膦酸鈉通過激活ERK1/2和JNK信號(hào)途徑，而不是p38，發(fā)揮促進(jìn)骨質(zhì)疏松大鼠來源的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，并抑制其成脂分化，其作用具有濃度依賴性。 2.