阿倫膦酸鈉對(duì)大鼠股骨骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程的影響.pdf

1、第一部分大鼠骨質(zhì)疏松性動(dòng)物模型建立
　　目的:觀察切除卵巢對(duì)雌性SD大鼠股骨骨密度和生物力學(xué)特性的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供有效的骨質(zhì)疏松模型。
　　方法:選用100只4月齡成年雌性Sprague—Dawley(SD)大鼠，體重250-300克，隨機(jī)分為空白組5只，剩余95只大鼠在無菌條件下切除雙側(cè)卵巢進(jìn)行去勢(shì)，建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。術(shù)后8周，應(yīng)用小動(dòng)物Micro-CT對(duì)近端股骨進(jìn)行掃描與三維重建分析;用雙能X線檢測(cè)去勢(shì)組大鼠與空

2、白組大鼠骨密度并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;采用生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)，比較去勢(shì)組大鼠和空白組大鼠骨的力學(xué)強(qiáng)度。
　　結(jié)果:Micro-CT檢測(cè)結(jié)果表明，去勢(shì)組大鼠骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)如骨小梁厚度、骨皮質(zhì)厚度和骨小梁數(shù)量明顯低于空白組。雙能X線檢測(cè)顯示8周以后，去勢(shì)組大鼠與空白組大鼠骨密度分別為0.219±0.039(g/cm2)和0.249±0.063(g/cm2)，骨密度與空白組大鼠有明顯差別（P＜0.05）。生物力學(xué)研究測(cè)試顯示與空白對(duì)照組相比，去勢(shì)8周以

3、后其力學(xué)強(qiáng)度出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過對(duì)雌性大鼠采取切除卵巢去勢(shì)的方式，能夠在8周后建立鼠的骨質(zhì)疏松模型。這是一種指導(dǎo)骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)理的探究和新藥的研發(fā)理想實(shí)用的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。
　　第二部分阿倫膦酸鈉在大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:本研究是以去卵巢Sprague-Dawley(SD)大鼠建立的骨質(zhì)疏松骨折模型為研究對(duì)象，通過檢測(cè)骨生物力學(xué)性能的變化情況和利用

4、組織形態(tài)學(xué)、免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)方法，探討阿倫膦酸鈉對(duì)大鼠股骨骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程的相關(guān)因子在不同時(shí)期生物學(xué)特征的影響，以闡明其作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用阿倫膦酸鈉防治骨質(zhì)疏松性骨折提供理論依據(jù)和有益線索。
　　方法:造模成功后將模型組內(nèi)的60只大鼠右側(cè)股骨制作成中段開放性骨折并予克氏針內(nèi)固定。剩余的30只僅穿克氏針，不造成骨折作為假手術(shù)組。骨折模型組隨機(jī)分成對(duì)照組和治療組，每組30只;阿倫膦酸鈉組:骨折固定術(shù)后二膦酸鹽藥物

5、按1.15mg/(kg.week)灌胃，每周一次;假手術(shù)和對(duì)照組:骨折固定術(shù)后給予同樣劑量及次數(shù)的生理鹽水灌胃。分別于術(shù)后1，2，4，6，8和12W各組隨機(jī)選取5只大鼠摘眼球取血，離心取血清，測(cè)定ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1的表達(dá)變化。行雙能X線檢查比較各組骨折愈合情況。處死大鼠后，在骨折端取骨痂標(biāo)本，4％多聚甲醛固定過夜。各組經(jīng)5％硝酸脫鈣組織石蠟切片行HE和抗酒石酸(TRAP)染色、BMP-2、bFGF、IGF-1免疫組

6、化檢測(cè)，并對(duì)第4和12周的股骨標(biāo)本進(jìn)行Micro-CT，掃描電鏡觀察和三點(diǎn)彎曲生物力學(xué)檢測(cè)各組骨折愈合情況。
　　結(jié)果:骨痂的雙能X線檢測(cè)和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比經(jīng)阿倫膦酸鈉治療兩周后骨折愈合進(jìn)程明顯加快。第2周組織切片HE染色發(fā)現(xiàn)，阿倫膦酸鈉組骨痂形成增多，軟骨內(nèi)成骨過程較對(duì)照組加快。連續(xù)治療6周后，對(duì)照組骨折線清晰可見，阿倫膦酸鈉組骨折線模糊，提示更早達(dá)到骨性愈合。藥物干預(yù)治療后，與對(duì)照組相比阿倫膦酸鈉組TRAP染色破骨

7、細(xì)胞數(shù)量明顯減少且成逐漸減少趨勢(shì)。ELISA結(jié)果顯示，假手術(shù)組血清中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1在所有時(shí)間段內(nèi)無顯著性差異。阿倫膦酸鈉組血清ALP和對(duì)照組相比在第2、4和6周的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療兩周后，阿倫膦酸鈉組和對(duì)照組中BMP-2、bFGF、IGF-1的表達(dá)均達(dá)到高峰，8～12周時(shí)回落到正常水平。治療前8周，對(duì)照組血清中BMP-2少于阿倫膦酸鈉組，兩組在第2和6周的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后第4和8周，對(duì)照組中bFGF

8、少于阿倫膦酸鈉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比，治療后第2和4周阿倫膦酸鈉組血清中IGF-1升高明顯，兩組見差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果顯示阿倫膦酸鈉組和對(duì)照組在骨折愈合中BMP-2、bFGF、IGF-1的表達(dá)細(xì)胞定位無差別。治療4周后BMP-2免疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對(duì)照組，8周時(shí)低于對(duì)照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療4，8周后bFGF免疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療2和4周后IGF-1免

9、疫組化平均光密度值阿倫膦酸鈉組高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Micro CT成像顯示對(duì)照組的骨痂體積和礦化比例在治療后4周明顯少于阿倫膦酸鈉組，而治療12周后沒有明顯改變。SEM結(jié)果顯示，治療12周后阿倫膦酸鈉組骨痂組織吸收陷窩數(shù)明顯低于對(duì)照組。生物力學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)阿倫膦酸鈉組標(biāo)本最大載荷均高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:阿倫膦酸鈉具有上調(diào)大鼠骨質(zhì)疏松性骨折愈合過程中ALP、BMP-2、bFGF、IGF-1等促進(jìn)成骨的