Lewis y抗原對人卵巢癌細胞RMG-I-H部分耐藥相關蛋白基因表達的影響.pdf

1、目的：通過檢測α1，2—FT基因轉染前后的人卵巢癌細胞系RMG—I和RMG—I—H及Lewisy單克隆抗體處理前后細胞系RMG—I—H部分耐藥相關蛋白基因：多藥耐藥基因—1(MDR—1)，多藥耐藥相關蛋白—1(MRP—1)、多藥耐藥相關蛋白—2(MRP—2)、蛋白激酶C-α(PKC-α)及拓撲異構酶Ⅰ(TopoⅠ)的表達差異，探討Lewisy抗原與耐藥相關蛋白基因的表達調節(jié)的相關性，為研究Lewisy抗原在人上皮性卵巢癌耐藥機制中的作用

2、奠定基礎。 方法：①RMG—I為人卵巢透明細胞癌株，RMG—I—H為RMG—I穩(wěn)定轉染表達載體pcDNA3.1(-)—HFUT—H(含1，2—FT基因)獲得的Lewisy高表達細胞系。②取對數(shù)生長期RMG—I—H及RMG—I細胞，RNAout試劑常規(guī)提取細胞總RNA。各取4μg總RNA反轉錄合成cDNA，反應條件為70℃10 min，冰上冷卻2 min以上，42℃60 min，70℃15 min。取逆轉錄產物行PCR擴增，反應條

3、件為：94℃3 min后，以適當?shù)难h(huán)數(shù)進行以下反應：94℃40 s；退火溫度1 min；72℃1 min，最后為72℃7 min。PCR產物在3.0％瓊脂糖凝膠中進行電泳后，經電泳凝膠成象分析儀拍照并分析處理。以各自內參照β—actin表達量為基準計算各條帶的相對含量，進行基因表達水平的半定量分析。實驗重復進行3次。③取RMG—I—H及RMG—I細胞，各懸浮于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，接種到預先放置7 mm×22 mm蓋玻片的

4、培養(yǎng)皿(35 mm)中，置CO2孵箱培養(yǎng)2d，待細胞接近長成單層，取出蓋玻片，浸入PBS洗2次，4％多聚甲醛固定，染色方法按SP試劑盒說明書進行。一抗兔抗人P—gp多克隆抗體1:100稀釋。在40倍鏡下觀察，以細胞漿、細胞膜有棕黃色顆粒著色為陽性。實驗重復三次。圖像分析軟件Meta Morph分析結果。④取RMG—I—H及RMG—I細胞制成單細胞懸液，記數(shù)活細胞數(shù)，調整細胞密度為1×106/ml，選取10只4～6周齡健康雌性裸鼠，體重(

5、20.4±0.6)g，隨機分成兩組，于背部皮下注射細胞懸液0.3ml。裸鼠在SPF條件下飼養(yǎng)，定期觀察小鼠精神、飲食及排便情況。五周后處死全部裸鼠，取出皮下瘤塊，分離，制備成石臘塊。⑤取指數(shù)生長期RMG—I—H細胞制成單細胞懸液，2×105/培養(yǎng)皿接種子7個35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)36 h后棄去培養(yǎng)液，收集1個培養(yǎng)皿中的細胞，提取RNA，以此時作為0時間點。同時另6個培養(yǎng)皿加入含2％胎牛血清的培養(yǎng)液，其中3個培養(yǎng)皿中加入抗Lewisy單

6、克隆抗體，使其終濃度為10 ug/ml，作為實驗組(抗體處理組)：不予處理的3個培養(yǎng)皿作為對照組(非處理組)。再繼續(xù)培養(yǎng)6，9，24 h后，分別取實驗組和對照組各一個培養(yǎng)皿，提取細胞RNA，進行RT-PCR，檢測MDR—1、PKC-α、MRP—1、MRP—2及TopoⅠ的mRNA的表達。⑥應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件，檢測數(shù)據以x±s表示，兩組間比較進行t檢驗，多組間比較采用方差分析方法。P<0.05視為有統(tǒng)計學意義。 結果

7、：⑴RT-PCR檢測結果證明，RMG—I—H細胞中PKC-α、TopoⅠ、MRP—1及MRP—2的mRNA相對表達量分別為0.46±0.02、0.82±0.08、0.66±0.07和0.44±0.08，與其在RMG—I中的相對表達量0.27±0.05、0.52±0.04、0.34±0.12及0.23±0.05相比均明顯增高(P均<0.05)；而MDR—1在RMG—I—H細胞中(0.26±0.05)的相對表達量低于其在RMG—I中(0.4

8、5±0.08)的表達P<0.05。⑵SP染色結果表明，在RMG—I—H細胞中P—gp染色陽性顆粒呈棕黃色或棕褐色，廣泛分布于細胞膜和細胞漿，其累積光密度為29.75±2.01；在RMG—I細胞中P—gp染色陽性顆粒呈淡黃色，彌散分布于細胞膜和細胞漿，累積光密度為17.05±0.56，RMG—I—H細胞的染色強度明顯高于RMG—I(P=0.037)。⑶P—gp在裸鼠皮下移植瘤組織中染色狀態(tài)如同細胞學，在RMG—I—H細胞移植瘤的組織中的染

9、色較強，呈棕褐色或棕黃色，累積光密度為49.58±6.93；而在RMG—I細胞移植瘤的組織中染色呈淡棕黃色，累積光密度為20.09±4.09(P=0.023)。⑷RMG—I—H細胞Lewisy糖基抗原被濃度為10 ug/ml的Lewisy單克隆抗體封閉后，MDR—1、MRP—1、MRP—2、PKC-α及TopoⅠmRNA的表達強度隨處理時間的延長逐漸降低(P均<0.05)，在24 h達到最低，而非處理組的變化則不明顯(P均>0.05)。

10、另外，在6 h這一時間點抗體處理組的MDR—1、MRP—1 MRP—2、PKC-α及TopoⅠ的mRNA相對含量(0.36±0.05、0.18±0.02、0.15±0.04、0.40±0.09、0.42±0.03)均低于非處理組(0.70±0.07、0.80±0.04、0.51±0.08、0.74±0.13、0.77±0.13)，P均<0.05，其抑制率分別為48.55％、77.50％、70.18％、45.86％和46.13％。