野生水禽副粘病毒的分離鑒定及V蛋白對(duì)抗宿主細(xì)胞先天免疫機(jī)制的研究.pdf

1、新城疫是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種烈性傳染病，發(fā)病急，感染率和死亡率高（有時(shí)高達(dá)100％），它主要危害禽類。該病分布廣泛，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)危害極大。針對(duì)新城疫病毒的分子流行病學(xué)研究主要集中于家禽和水禽，而作為新城疫病毒的天然宿主，野生鳥類在病毒傳播過(guò)程中所起到的作用并未引起足夠的重視。野生鳥類作為許多病原攜帶者和自然宿主，可潛在傳播人和動(dòng)物的重要傳染病。隨著候鳥的遷徙，攜帶某些病毒的候鳥可能

2、會(huì)將病毒傳播到不同的地方而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)和流行。因此，對(duì)野生鳥類進(jìn)行常見病原的分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)，具有重要的指示意義。為研究野生鳥類感染或攜帶新城疫病毒的情況，本研究對(duì)2011年10月至2013年5月期間收集自吉林省向海自然保護(hù)區(qū)的野生鳥類糞便拭子共計(jì)1002份，進(jìn)行新城疫病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查。一方面調(diào)查新城疫病毒的攜帶情況，進(jìn)行病毒的分離與鑒定，并選取有代表性的毒株進(jìn)行基因克隆和序列的分子遺傳特征分析;另一方面，首次分離到6型禽副粘病

3、毒(avian paramyxovirus virus type6，APMV6)，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序。
　　1、野生鳥類糞便拭子的PCR檢測(cè)
　　將糞便拭子按常規(guī)方法無(wú)菌處理后，接種SPF雞胚，72h后收集尿囊液，提取尿囊液中的病毒RNA，用特異性的檢測(cè)新城疫病毒和禽副粘病毒的PCR方法進(jìn)行初步檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明野鳥存在NDV以及APMV6的感染。所有野生鳥類樣品的NDV PCR陽(yáng)性檢出率為4.19％，APMV6 PCR

4、陽(yáng)性檢出率為0.2％。野生鳥類新城疫病毒攜帶情況不具明顯的季節(jié)性，不同年份野鳥的NDV檢出率有一定差別，其中2011年NDV陽(yáng)性檢出率最高，為14.02％。
　　2、野鳥源NDV的分離鑒定及F基因遺傳演化分析
　　將用NDV PCR檢測(cè)引物初篩為陽(yáng)性的尿囊液經(jīng)適當(dāng)處理后接種雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)培養(yǎng)增殖，進(jìn)行蝕斑純化。經(jīng)特異性PCR、血凝試驗(yàn)及血凝抑制試驗(yàn)鑒定，確定共分離到42株野鳥源NDV。對(duì)42株病毒的毒力基因F基因進(jìn)

5、行部分克隆和序列測(cè)定，與GenBank上已發(fā)表的NDV參考株進(jìn)行序列比對(duì)和分析。測(cè)序結(jié)果顯示42株分離株均為弱毒株，其中3株屬于classⅠ genotype2，另外39株屬于classⅡ genotypeⅠ。序列分析結(jié)果顯示:3個(gè)classⅠ分離株F基因核苷酸序列相似性為97.5％-98.9％;核苷酸遺傳進(jìn)化分析表明，這3株野鳥源NDV分離株與南方家禽分離株親緣關(guān)系較近。39株classⅡ分離株F基因核苷酸序列相似性為96.4％-10

6、0％,核苷酸遺傳進(jìn)化分析表明，毒株NEFU1301，NEFU1302，NEFU1102，NEFU1104，NEFU1113表現(xiàn)出高度的序列相似性，與2004-2006年間南方家禽分離株和遠(yuǎn)東及日本野鳥分離株親緣關(guān)系較近。另外34株classⅡ分離株親緣關(guān)系較近，處于另一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的集簇，但這39株分離株均與疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。結(jié)果說(shuō)明我國(guó)野生鳥類中存在NDV的感染，分離株均為弱毒株，提示強(qiáng)毒株在野鳥中并未廣泛流行;弱毒株在遠(yuǎn)東地區(qū)、日本

7、地區(qū)及中國(guó)東海岸線可能已經(jīng)發(fā)生廣泛交流;繹免疫的家禽可能無(wú)法抵御來(lái)自野鳥所攜帶病毒的感染。本研究選擇NDV代表株NEFU1106和NEFU1136進(jìn)行全基因組序列，獲得的GenBank登陸號(hào)分別為KF361507和KC894391。本研究既豐富了東北地區(qū)NDV的流行病學(xué)資料，又警示我們要對(duì)野生鳥類在NDV傳播中所起的作用引起重視，為深入研究NDV的傳播、遺傳、進(jìn)化等奠定基礎(chǔ)。
　　3、野鳥源APMV6的分離及其全基因組測(cè)序

8、　　通過(guò)副粘病毒通用引物PCR檢測(cè)及電鏡觀察，確定共分離到2株野鳥源APMV6，分別命名為JL190及JL127。設(shè)計(jì)特異性引物分16段擴(kuò)增這兩株病毒的基因組，通過(guò)軟件拼接獲得它們的全長(zhǎng)基因組序列。其基因組全長(zhǎng)為16236nt，獲得的GenBank登錄號(hào)分別為JX522537和KF267717;基因組結(jié)構(gòu)為3'leader-NP-P-M-F-SH-HN-L-Trailer5'，根據(jù)JL217的F基因及HN基因氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)

9、果表明，JL127株病毒與TW和FE株親緣關(guān)系較近，與HK株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　4、副粘病毒V蛋白對(duì)抗宿主細(xì)胞先天免疫機(jī)制的研究
　　擴(kuò)增新城疫病毒強(qiáng)毒株、弱毒株以及APMV6的V基因，將其克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒，分別與IFN-β-Luc、NF-κ_B-Luc、PRDⅢ/Ⅰ-Luc、AP-1-luc報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞，接種仙臺(tái)病毒刺激細(xì)胞后，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素