PK信號(hào)通路影響NSCLC細(xì)胞株中COX-2上調(diào)VEGF作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 近年研究證明，COX-2可通過上調(diào)前列腺素E2及其受體并激活蛋白激酶信號(hào)通路，上調(diào)腫瘤微環(huán)境中VEGF，從而對非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移及分子靶向治療耐藥的產(chǎn)生重要作用[1]。然而對于不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，COX-2具體通過PGE2下游的哪一條信號(hào)通路上調(diào)VEGF仍未成定論。
　　 本研究通過將COX-2、PKA選擇性抑制劑、PKC選擇性抑制劑及EP1/EP2選擇性抑制劑作用于各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株

2、，觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)及VEGF表達(dá)量的變化，從而研究蛋白激酶信號(hào)通路在不同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中對COX-2上調(diào)VEGF作用的影響。
　　 研究目的：
　　 研究非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，不同蛋白激酶(protein kinase，PK)信號(hào)通路對環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VascularEndothelial Growth Factor，VEGF)作用的影響。檢測COX-2

3、作用于各同非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的EC50值。
　　 研究方法：
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 A549細(xì)胞株用80％1640+20％胎牛血清培養(yǎng)，H460、A431及HBE用90％DMEM+10％胎牛血清培養(yǎng)，皆于5％CO2，37℃孵育。細(xì)胞貼壁長滿培養(yǎng)瓶后傳代，將細(xì)胞傳至4代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2檢測COX-2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的EC50值
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基沖洗3遍，以0.

4、25％胰酶消化3-5分鐘，使細(xì)胞間連接斷開呈單細(xì)胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100ul細(xì)胞懸液，使每孔細(xì)胞約8×103個(gè)(邊緣孔用無菌PBS填充)。5％CO2，37℃孵育12小時(shí)后，將COX-2原液稀釋為0-3000倍濃度梯度，分別加入96孔板中。5％CO2、37℃孵育24小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20ul5mg/ml MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)溶

5、液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。同時(shí)設(shè)置空白對照組(培養(yǎng)基)，陰性對照組(細(xì)胞)。細(xì)胞生存力=藥物組平均吸光光度值/陰性對照組平均吸光光度值，由細(xì)胞生存力與藥物濃度在EXCEL中行線性回歸分析，得出EC50值。上述過程，每株細(xì)胞重復(fù)3次。
　　 3流式細(xì)胞技術(shù)定量檢測VEGF的表達(dá)
　　

6、 3.1證實(shí)在各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，COX-2可促進(jìn)VEGF上調(diào)
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基小心沖洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細(xì)胞間連接斷開呈單細(xì)胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔細(xì)胞約5×105個(gè)。5％CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(約12-24小時(shí))。血清饑餓12小時(shí)，從0-2倍EC50建立COX-2濃度梯度作用于各細(xì)胞株.設(shè)3個(gè)復(fù)孔，5％C

7、O2，37℃孵育12小時(shí)，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細(xì)胞間連接斷開呈單細(xì)胞懸液，分孔收集細(xì)胞，分別用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗標(biāo)記各組細(xì)胞表達(dá)的VEGF，并以流式細(xì)胞技術(shù)檢測各濃度梯度組VEGF的吸光率，分析吸光率的幾何平均數(shù)與COX-2濃度間的關(guān)系。
　　 3.2檢測COX-2、AH6809、KT5720、RO-31-8425作用于各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株后VEGF表達(dá)量的變化
　　 將培養(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞用無血

8、清培養(yǎng)基小心沖洗3遍，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，使細(xì)胞間連接斷開呈單細(xì)胞懸液，以含血清培養(yǎng)基中和胰酶。將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔加入1.5ml使每孔細(xì)胞約5×105個(gè)。5％CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底(約12-24小時(shí))。血清饑餓12小時(shí)，設(shè)置不加藥物細(xì)胞組、COX-2組、COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組、AH6809組、KT5720組、RO-31-8425組，在

9、COX-2組、COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組中先加入已測得濃度得COX-2，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)5％CO2，37℃孵育12小時(shí)，分別在COX-2+AH6809組、COX-2+KT5720組、COX-2+RO-31-8425組、AH6809組、KT5720組、RO-31-8425組中加入所需抑制劑劑，繼續(xù)5％CO2，37℃孵育12小時(shí)，終止培養(yǎng)，以0.25％胰酶消化3-5分鐘，

10、使細(xì)胞間連接斷開呈單細(xì)胞懸液，分別用鼠抗人VEGF一抗及兔抗鼠二抗標(biāo)記各組細(xì)胞表達(dá)的VEGF，并以流式細(xì)胞技術(shù)檢測各濃度梯度組VEGF的吸光率，上述過程，每株細(xì)胞重復(fù)3次。對各組細(xì)胞表達(dá)VEGF吸光率的幾何平均數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn)。
　　 4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
　　 研究結(jié)果：
　　 1 COX-2作用于A549、H460及A4

11、31的EC50值(MTT法)COX-2作用于A549、H460及A431的EC50值分別是：8.95nmol/l，11.2nmol/l及8.44nmol/l。COX-2對HBE細(xì)胞的增長無明顯影響。
　　 2 COX-2在一定濃度范圍內(nèi)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的增殖。
　　 3 PKC選擇性抑制劑可明顯抑制由COX-2引起的VEGF的上調(diào)；在大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，EP2選擇性抑制劑對由COX-2引起的VEGF的上調(diào)有一定

12、的影響。
　　 在各非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，蛋白激酶C(PKC)選擇性抑制劑可明顯抑制由COX-2引起的VEGF的上調(diào)，而蛋白激酶A(PKA)選擇性抑制劑的此種抑制作用不明顯。在大細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，EP2選擇性抑制劑對由COX-2引起的VEGF的上調(diào)有一定的影響。
　　 結(jié)論：
　　 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中，由COX-2過表達(dá)引起的VEGF的上調(diào)與PKC激酶信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)；對大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460，由COX-2過表達(dá)