在p38MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路應(yīng)用脫氧膽酸誘導(dǎo)Barrett食管發(fā)生機(jī)制的作用.pdf

1、Barrett食管(Barrett's esophagus，BE)是由食管下段的復(fù)層鱗狀上皮被化生的單層柱狀上皮所替代發(fā)展而來。研究發(fā)現(xiàn)，Barrett食管與食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)的發(fā)生密切相關(guān)，Barrett食管患者發(fā)生食管腺癌的危險(xiǎn)性比普通人群增加30倍。Barrett食管粘膜的癌變是一個(gè)多階段復(fù)雜的過程，經(jīng)歷化生一間變一癌變?nèi)齻€(gè)階段。
　　 膽汁作為十二指腸反流物的重要反流物

2、質(zhì)，在胃食管反流病，如反流性食管炎、Barrett食管及其并發(fā)食管腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。脫氧膽酸(Deoxycholic acid，DCA)作為膽汁的重要成分，與Barrett食管和食管腺癌的發(fā)生密切相關(guān)。但其誘導(dǎo)Barrett食管和食管腺癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制目前尚不明確，有待于進(jìn)一步研究。
　　 p38分裂激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38MAPKs)是一種絲

3、氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)通路的作用途徑之一，它在外界各種刺激條件的作用下，活化為磷酸化p38(p-p38)參與細(xì)胞內(nèi)凋亡、分化、炎癥、應(yīng)激等。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞向腸道上皮的生長(zhǎng)和分化過程中p38MAPKs的表達(dá)顯著增加，特異性的分布于小腸的絨毛上皮細(xì)胞核中。近年來利用小腸特異性標(biāo)志物蔗糖-異麥芽糖酶及粘蛋白分泌物檢測(cè)食管腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的研究顯示，腸化生型Barrett食管與正常小腸上皮存在共性。同源異型框轉(zhuǎn)錄因子(cauda

4、l-relatedhomeodomain transcription 2，CDX2)在正常生物體發(fā)育過程中對(duì)消化道特別是結(jié)腸和小腸上皮的發(fā)育起著關(guān)鍵的作用，但在正常食管和胃黏膜上皮中不表達(dá)。反流性食管炎所致的Barrett食管中食管的鱗狀上皮被腸上皮所代替，CDX2的表達(dá)呈明顯增強(qiáng)趨勢(shì)。近期有國內(nèi)學(xué)者研究證實(shí)，在胃黏膜病變中p-p38在腸化生形成中對(duì)CDX2表達(dá)可能起正向調(diào)節(jié)作用。然而在Barrett食管的發(fā)生機(jī)制中，是否也存在p38M

5、APKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過調(diào)節(jié)CDX2表達(dá)誘導(dǎo)Barrett食管腸化生，國內(nèi)尚未見報(bào)道。
　　 目的：應(yīng)用脫氧膽酸誘導(dǎo)體外培養(yǎng)正常食管黏膜上皮細(xì)胞，從p38MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手，探討脫氧膽酸誘導(dǎo)Barrett食管的發(fā)生機(jī)制。
　　 方法：經(jīng)HE染色檢驗(yàn)，僅選取病理診斷正常的食管黏膜標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定體外培養(yǎng)的食管黏膜上皮細(xì)胞為有增殖能力的食管黏膜上皮細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度的脫氧膽酸及p38MAPK

6、s特異抑制劑SB203580干預(yù)人正常食管上皮細(xì)胞，用Western blot方法檢測(cè)p38、p-p38和CDX2蛋白的表達(dá)變化，評(píng)估p-p38和CDX2表達(dá)變化的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1 脫氧膽酸對(duì)p-p38蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blot分析顯示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度DCA(100μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L)作用于食管上皮細(xì)胞24h后

7、，t-p38的表達(dá)量沒有明顯變化，對(duì)照組表達(dá)為(73.2±1.3)，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)分別為(76.8±1.5)、(77.8±1.9)、(75.5±2.3)、(72.6±1.0)。而隨著DCA濃度的逐漸增高，p38磷酸化的水平逐漸增多，在500μmol/L時(shí)p38磷酸化水平最高，對(duì)照組表達(dá)為(13.7±1.0)％，實(shí)驗(yàn)組表達(dá)分別為(17.1±1.4)％、(29.7±2.1)％、(44.0±1.7)％、(26.0±1.5)％。實(shí)驗(yàn)組p38磷酸化水

8、平均高于對(duì)照組，分別為p＜0.05、p＜0.01、p＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度實(shí)驗(yàn)組之間比較p＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2 脫氧膽酸對(duì)CDX2蛋白表達(dá)的影響
　　 Western blot分析顯示，空白對(duì)照組CDX2蛋白無表達(dá)，隨著DCA濃度的逐漸增高，CDX2蛋白的表達(dá)逐漸增高，分別為(0.42±0.03)、(5.63±0.52)、(8.59±1.25)、(6.19±1.16)，在500μmol

9、/L時(shí)CDX2蛋白的表達(dá)量最高。100μmol/L組與空白對(duì)照組比較p＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L組與空白對(duì)照組和100μmol/L組比較均為p＜0.01，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3 阻斷p38MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后，脫氧膽酸對(duì)p-p38和CDX2蛋白表達(dá)的影響
　　 先用20μmol/L的p38MAPKs特異性抑制劑SB203580預(yù)處理食管上皮細(xì)胞2h

10、，用PBS沖洗3次，加入含有500μmol/L DCA的D-KSFM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，p38磷酸化水平較單用500μmol/L DCA處理的食管上皮細(xì)胞明顯降低((28.3±2.2)％vs(50.5±9.5)％，p＜0.01)，但仍高于空白對(duì)照組((28.3±2.2)％vs(13.8±0.9)％，p＜0.05)。而SB203580本身對(duì)p38磷酸化水平無影響((14.9±7.7)％vs(13.8±0.9)％，p＞0.05)。

11、　　 上述同樣的分組處理測(cè)CDX2蛋白的表達(dá)量，空白對(duì)照組與SB203580組均無CDX2蛋白表達(dá)，SB203580+DCA組蛋白表達(dá)量(0.94±0.13)明顯低于DCA組(2.31±0.41)，p＜0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1 脫氧膽酸可以誘導(dǎo)人正常食管黏膜上皮細(xì)胞p38磷酸化水平增加，并在一定程度上隨著濃度的增加效果更強(qiáng)。
　　 2 CDX2在正常食管黏膜上皮中不表達(dá)，脫氧膽酸可以誘