色素上皮衍生因子在皮膚中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、研究背景：色素上皮衍生因子是一分子量為50-KDa的內(nèi)源性可溶性分泌蛋白，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。近期的研究發(fā)現(xiàn)，PEDF在人體廣泛分布，見(jiàn)于人角膜上皮、腎臟、胰腺、前列腺、骨組織、牙齒、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及外周血等組織。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，PEDF表達(dá)于肺、皮膚和子宮內(nèi)膜間質(zhì)的成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等。目前已證實(shí)PEDF是一個(gè)作用強(qiáng)效和廣泛的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞分化和減

2、少腦脊髓病變傷害作用。體外實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，PEDF能夠劑量依賴性抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移，強(qiáng)于其他血管新生抑制劑如內(nèi)皮抑素和凝血栓蛋白-1。在大部分的實(shí)體腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中，PEDF表達(dá)降低或丟失。研究顯示PEDF的降低和多種腫瘤侵襲增加和預(yù)后不良相關(guān)，如前列腺癌、胰腺癌、骨肉瘤、乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤和神經(jīng)膠質(zhì)瘤。近來(lái)一些實(shí)驗(yàn)證實(shí)PEDF還具有免疫調(diào)節(jié)和對(duì)抗氧化應(yīng)激等功能。在有關(guān)皮膚PEDF的研究中，最早有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)PEDF主要分布于真

3、皮層，而表皮層僅表達(dá)少量的PEDF。然而最近有Abe研究小組有不同的報(bào)道，他們發(fā)現(xiàn)PEDF在正常皮膚表皮和真皮層均表達(dá)，且表皮表達(dá)明顯高于真皮層。因此，需要對(duì)皮膚中PEDF表達(dá)及功能深入進(jìn)行研究。本研究分為三個(gè)部分：
　　 第一部分：色素上皮衍生因子在HaCaT細(xì)胞上的表達(dá)和功能研究。
　　 目的：明確PEDF在HaCaT細(xì)胞的表達(dá)情況以及對(duì)其增殖遷移和粘附等細(xì)胞功能的影響。
　　 方法：采用RT-PCR和Wes

4、tern-blot檢測(cè)HaCaT細(xì)胞PEDF以及PEDF受體mRNA和蛋白的表達(dá)；間接免疫熒光檢測(cè)PEDF的細(xì)胞定位情況；MTT方法檢測(cè)PEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)PEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞遷移的影響；結(jié)晶紫染色法檢測(cè)PEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞粘附功能的影響；Western-blot方法檢測(cè)PEDF對(duì)HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38、JNK和AKT信號(hào)通路的影響。
　　 結(jié)果

5、：HaCaT細(xì)胞在mRNA和蛋白水平均可檢測(cè)到PEDF和PEDF受體的表達(dá)。PEDF熒光信號(hào)主要位于胞漿內(nèi)。此外，50ng/ml的VEGF165可以降低HaCaT細(xì)胞PEDF蛋白表達(dá)。50ng/ml的PEDF可以抑制HaCaT細(xì)胞的增殖和遷移，增加其粘附。PEDF可以降低ERK1/2的磷酸化，而對(duì)p38、JNK和AKT信號(hào)通路無(wú)影響。
　　 結(jié)論：PEDF表達(dá)于HaCaT細(xì)胞，PEDF可能通過(guò)ERK1/2通路抑制HaCaT細(xì)胞增

6、殖和遷移。
　　 第二部分：正常和銀屑病皮膚PEDF表達(dá)的研究。
　　 目的：明確PEDF在正常人和銀屑病皮膚組織、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)情況。
　　 方法：采用免疫組化方法檢測(cè)正常和銀屑病皮膚組織PEDF表達(dá)情況。分離正常及銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞。使用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)正常健康人和銀屑病患者表皮角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞PEDFmRNA和蛋白的表達(dá)

7、。
　　 結(jié)果：免疫組化提示在正常健康成人表皮中PEDF主要表達(dá)于基底層和鄰近基底層的棘細(xì)胞層，和正常皮膚、銀屑病非皮損區(qū)、鄰近皮損區(qū)皮膚相比，銀屑病皮損區(qū)PEDF表達(dá)較高。和正常皮膚來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，銀屑病皮損區(qū)、鄰近皮損區(qū)和銀屑病非皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞PEDF mRNA表達(dá)較高。而正常皮膚、銀屑病非皮損區(qū)、鄰近皮損區(qū)和銀屑病皮損區(qū)成纖維細(xì)胞PEDF mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異。銀屑病來(lái)源的角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞PEDF的蛋

8、白表達(dá)水平類似mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：PEDF在銀屑病皮損表皮表達(dá)明顯增加，可能參與了銀屑病的發(fā)病。
　　 第三部分：色素上皮衍生因子在皮膚附屬器表達(dá)。
　　 目的：明確PEDF在皮膚附屬器的表達(dá)情況以及相關(guān)功能。
　　 方法：采用免疫組化方法檢測(cè)正常皮膚附屬器的PEDF表達(dá)情況。使用RT-PCR、Western-blot方法和間接免疫熒光方法檢測(cè)外根鞘細(xì)胞PEDF mRNA和蛋白的表達(dá)。采用細(xì)胞劃痕

9、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PEDF對(duì)外根鞘細(xì)胞遷移的影響。
　　 結(jié)果：PEDF主要表達(dá)于毛囊的表皮基質(zhì)、內(nèi)毛根鞘、外毛根鞘和纖維鞘部位，在皮脂腺和汗腺等也有表達(dá)。體外培養(yǎng)的外根鞘細(xì)胞表達(dá)PEDF mRNA和蛋白，PEDF在其胞漿和胞核均有表達(dá)。25ng/ml的IL-4和IL-17尤其是IL-4可以上調(diào)外根鞘細(xì)胞PEDF的表達(dá)。此外，50ng/ml的PEDF可以抑制外根鞘細(xì)胞的遷移。
　　 結(jié)論：PEDF表達(dá)于毛囊、皮脂腺和汗腺以及體外培