薏苡附子敗醬散對(duì)TNBS結(jié)腸炎模型大鼠Treg-Th17的影響及作用機(jī)制.pdf

1、研究目的:
　　明確薏苡附子敗醬散(YFB)對(duì)UC免疫調(diào)節(jié)過程中Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)因素及其平衡的調(diào)控作用，了解YFB對(duì)UC的療效及作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　采用三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇法制作UC大鼠模型，按薏苡附子敗醬散原方配伍比例（薏苡仁30g、附子6g、敗醬草15g）常規(guī)煎煮，分別配置成0.3g/ml、0.6g/ml、1.2g/ml的制劑，將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照

2、組、5-ASA組、YFB低劑量組、YFB中劑量組、YFB高劑量組，治療14d后取標(biāo)本。(1)觀察TNBS/乙醇法的造模效果。(2)觀察不同劑量(3、6、12g/kg) YFB對(duì)造模大鼠結(jié)腸形態(tài)及組織病理學(xué)的影響;(2)采用ELISA法測定血清中IL-23、TGF-β、IL-17、IL-10的含量;(3)采用Western blot法測定結(jié)腸組織中STAT3、Smad2蛋白含量;(4)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)腸組織中RORγt、Fo

3、xp3 mRNA含量。(5)采用免疫熒光法測定結(jié)腸組織中Foxp3、Rorγ t蛋白含量。
　　研究結(jié)果:
　　(1) TNBS/乙醇造模后，大鼠出現(xiàn)少動(dòng)，進(jìn)食減少，體重減輕，腹瀉、血便等癥狀;解剖見結(jié)腸與周圍組織粘連伴腸腔擴(kuò)大，腸壁增厚，黏膜水腫、充血、有潰瘍形成;病理見黏膜層缺失，腺體破壞，杯狀細(xì)胞丟失，固有層增厚，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤。模型組體重增加值、結(jié)腸大體形態(tài)評(píng)分及病理評(píng)分與正常組相比差異明顯（P均＜0.05

4、），造模成功。
　　(2)模型大鼠治療后，腹瀉、便血減輕，體重上升，結(jié)腸粘連情況好轉(zhuǎn)，腸壁增厚較輕，黏膜充血水腫改善，上皮基本完整，潰瘍基本愈合，炎性細(xì)胞浸潤基本消失，各治療組體重增加值、結(jié)腸大體形態(tài)評(píng)分及病理評(píng)分與模型組有顯著差異(P均＜0.05)，YFB各劑量組以中劑量最佳（P均＜0.05），YFB中劑量組在體重增長方面與5-ASA無明顯差異(P＞0.05)，在改善結(jié)腸大體形態(tài)評(píng)分及病理評(píng)分方面優(yōu)于5-ASA組（P均＜0.05

5、）。相關(guān)性分析顯示，結(jié)腸大體形態(tài)學(xué)評(píng)分與病理學(xué)評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.924，P＜0.01)。
　　(3)ELISA結(jié)果顯示:模型組血清IL-23、IL-17含量較正常組明顯增加（P均＜0.05），各治療組血清IL-23、IL-17含量較模型組明顯下降（P均＜0.05），YFB中劑量組下降最為明顯，與其余各治療組比較，有顯著差異（P均＜0.05）。模型組血清TGF-β、IL-10含量較正常組下降明顯(P＜0.05)，5-ASA組及Y

6、FB中劑量組血清TGF-3、IL-10含量與模型組比較顯著上升（P均＜0.05），兩者比較無明顯差異（P均＞0.05），YFB低劑量組及高劑量組與模型組比較也無明顯差異（P均＞0.05）。相關(guān)性分析顯示，IL-23與TGF-β負(fù)相關(guān)(r=-0.715，P＜0.01)，與IL-17正相關(guān)(r=0.884，P＜0.01)，與IL-10負(fù)相關(guān)(r=-0.642，P＜0.01);TGF-3與IL-17負(fù)相關(guān)(r=-0.573，P＜0.01)，與

7、IL-10正相關(guān)(r=0.720，P＜0.01);IL-17與IL-10負(fù)相關(guān)(r=-0.555，P＜0.01)。
　　(4) Western blot結(jié)果顯示:模型組結(jié)腸黏膜STAT3蛋白的表達(dá)水平較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各給藥組與模型組比較，STAT3蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），YFB不同劑量比較，YFB中劑量組能顯著降低升高的STAT3蛋白含量（P均＜0.05），且優(yōu)于5

8、-ASA組(P＜0.05)。模型組結(jié)腸黏膜Smad2蛋白的表達(dá)水平較空白組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各給藥組與模型組比較，Smad2蛋白表達(dá)水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），YFB不同劑量比較，YFB中劑量組能顯著升高Smad2蛋白含量（P均＜0.05），且優(yōu)于5-ASA組(P＜0.05)。相關(guān)性分析顯示，STAT3蛋白與Smad2蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P＜0.01)。
　　(5) RT-P

9、CR結(jié)果顯示:模型組結(jié)腸黏膜Rorγt mRNA表達(dá)水平較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各給藥組與模型組比較，Rorγt mRNA表達(dá)水平下調(diào)，其中YFB中劑量組及5-ASA組下調(diào)明顯，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），兩組間比較無明顯差異(P＞0.05)。模型組結(jié)腸黏膜Foxp3 mRNA的表達(dá)水平較空白組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各給藥組與模型組比較，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平

10、增加，其中YFB中劑量組及5-ASA組增加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩組間比較無明顯差異(P＞0.05)。相關(guān)性分析顯示，結(jié)腸黏膜Rorγ t mRNA與Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)（r=-0.624，P＜0.01）。
　　(6)免疫熒光結(jié)果顯示:結(jié)腸組織中Rorγt及Foxp3蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，也可見于胞漿及間質(zhì)。模型組Rorγt蛋白表達(dá)水平較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各給藥組與模型組比

11、較，Rorγt蛋白表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），YFB各劑量間比較，YFB中劑量組能顯著降低Rorγt蛋白含量（P均＜0.05），但與5-ASA組比較無明顯差異(P＞0.05)。模型組Foxp3蛋白表達(dá)水平較空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);各給藥組與模型組比較，F(xiàn)oxp3蛋白表達(dá)水平上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），YFB各劑量間比較，YFB中劑量組能顯著增加Foxp3蛋白含量（P均＜0.0

12、5），但與5-ASA組比較無明顯差異(P＞0.05)。相關(guān)性分析顯示:結(jié)腸組織Rorγ t蛋白及Foxp3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.887，P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　(1)應(yīng)用TNBS/乙醇法成功建立UC的大鼠模型，此造模方法有效，可被復(fù)制。
　　(2) YFB能改善UC模型大鼠的炎癥癥狀，促進(jìn)潰瘍修復(fù)，對(duì)UC模型大鼠具有治療作用。
　　(3) YFB能夠降低血清IL-17、IL-23的含量，增加T

13、GF-β、IL-10的含量;下調(diào)轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子STAT3蛋白表達(dá)水平，上調(diào)Smad2蛋白表達(dá)水平;降低轉(zhuǎn)錄因子Rorγt的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)，提高Foxp3的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)，提示YFB對(duì)Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞相關(guān)因素具有調(diào)控作用。
　　(4)相關(guān)性分析表明，結(jié)腸大體形態(tài)與病理組織學(xué)表現(xiàn)相互影響，具有一致性;IL-17、IL-23與TGF-β、IL-10在細(xì)胞因子水平維持平衡，STAT3與Smad2在信號(hào)傳導(dǎo)水平互相抑制，Ro