法舒地爾、TRPM8及microRNA-12a在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中的作用.pdf

1、研究背景:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是來源于中胚層的具有多向分化能力的干細(xì)胞,具有向軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、干細(xì)胞和造血細(xì)胞等多向分化及自我更新的功能,并且于一定條件下在體內(nèi)及體外可橫向分化為神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞。近來,已經(jīng)有很多動物實驗研究報道,可以用移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法來治療各種神經(jīng)系統(tǒng)的變性疾病、腦卒中及中樞損傷等,并取得了一定的效果。
　　 Rho

2、/Rho激酶(ROCK)信號通路包括有三種成分:Rho蛋白、Rho激酶及Rho激酶的效應(yīng)分子(ROCK),是體內(nèi)一條重要的信號通路,主要參與了調(diào)控細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、基因轉(zhuǎn)錄和凋亡等生物行為及功能,主要通過小G蛋白GDP-GTP之間的轉(zhuǎn)換,來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白骨架的聚合狀態(tài),從而扮演著“分子開關(guān)”的角色,并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架蛋白的合成、降解、移動和收縮等,因此對細(xì)胞的分裂、黏附、收縮、遷移和分泌等活動具有非常重要的調(diào)節(jié)作用。

3、我們觀察了ROCK抑制劑法舒地爾在體外誘導(dǎo)大鼠MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。
　　 TRP(transient receptor potential)通道是一類六次跨膜的非選擇性陽離子通道。它們在進(jìn)化中高度保守,在哺乳動物體內(nèi)廣泛表達(dá),參與了許多重要的生理學(xué)功能,如對溫度、痛覺、聽覺的感知。TRPM8通道是TRP的一個亞家族,在人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富,其主要生理功能是感知低溫。令人驚奇的是,本研究在誘導(dǎo)MSCs分化為神經(jīng)細(xì)

4、胞時,首次發(fā)現(xiàn)TRPM8出現(xiàn)表達(dá)。
　　 microRNA-124a是腦組織中表達(dá)最為豐富的一類microRNA,約占腦組織microRNA總量的25％-48％。Lim等人的研究表明,將microRNA-124a感染到HeLa細(xì)胞中導(dǎo)致一系列非神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)受到抑制,HeLa細(xì)胞的基因組表達(dá)模式向神經(jīng)方向轉(zhuǎn)化。在小鼠腦組織,microRNA-124只限于在已經(jīng)分化的和成熟的神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá),而在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)很少。本研究

5、通過構(gòu)建攜帶含有綠色熒光蛋白(green fluoreseence protein,GFP)報告基因的大鼠microRNA-124a慢病毒載體,將其感染至MSCs,并傳代,觀察其對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的影響。
　　 第一部分、法舒地爾誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化
　　 目的:探討Rho/Rh0激酶(ROCK)抑制劑法舒地爾在體外誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化中的可行性。
　　

6、 方法:全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠MSCs:采用法舒地爾誘導(dǎo)MSCs:倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)后各組的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;AO-EB染色法鑒定誘導(dǎo)后各組細(xì)胞存活率;免疫熒光法鑒定誘導(dǎo)后NSE、NF200、GFAP的表達(dá),判斷其分化情況。
　　 結(jié)果:AO-EB染色法鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞存活率誘導(dǎo)后存活細(xì)胞胞質(zhì)呈綠色,核為亮綠色,核形態(tài)規(guī)則,為圓形或橢圓形,死亡細(xì)胞胞質(zhì)呈紅色,核呈亮紅色,核皺縮或碎裂。隨著誘導(dǎo)時間延長,死亡細(xì)胞數(shù)量增加。通過AO

7、-EB染色法鑒定法舒地爾誘導(dǎo)30min、60min、90min、120min及180min,細(xì)胞的存活率分別為96.7±2.2％、95.3±1.9％、93.8±1.8％、92.5±2.1％及90.1±1.3％。
　　 誘導(dǎo)后免疫熒光鑒定法舒地爾誘導(dǎo)組,隨著誘導(dǎo)時間延長,NSE、NF200表達(dá)顯著增加,GFAP表達(dá)較少。誘導(dǎo)后60、90、120及180min,通過免疫熒光鑒定,NSE陽性率(分別為66.5±1.9％、88.1±3.

8、2％、93.6±1.9％、93.5±5.4％),NF200陽性率(分別為70.1±2.9％、89.5±1.3％、98.1±1.6％、98.3±1.9％)并呈逐漸增加的趨勢。而各組GFAP表達(dá)率均小于5％。
　　 第二部分、TRPM8在體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)是一類廣泛存在于細(xì)胞膜上的跨膜離子通道,可以辨別味覺、溫度覺等特殊感覺。

9、TRP通道亞型TRPM8主要存在于特定神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜上,當(dāng)溫度低于27℃或者薄荷醇存在的條件下,TRPM8通道開放,使Ca2+等帶正電的粒子進(jìn)入細(xì)胞,具有重要的生理意義。
　　 目的:本研究探討TRPM8在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化和基本作用。
　　 方法:在建立體外法舒地爾誘導(dǎo)大鼠MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞的基礎(chǔ)上,采用免疫細(xì)胞化學(xué)法、Western Blot法檢測TRPM8的表達(dá)變化。<

10、br>　　 結(jié)果:誘導(dǎo)前大鼠MSCs不表達(dá)TRPM8;誘導(dǎo)30min:MSCs開始表達(dá)TRPM8(45.3％±1.58％);誘導(dǎo)60min,表達(dá)較前增加(57,50％±2.45％);誘導(dǎo)后90min,TRPM8表達(dá)最高(89.56％±12.24％);誘導(dǎo)120min,TRPM8表達(dá)逐漸下降(59.25±9.15％),Western Blot也有類似的趨勢。
　　 第三部分、microRNA-124a慢病毒載體的構(gòu)建及感染大鼠骨

11、髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究
　　 目的：探討microRNA-124a在法舒地爾誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化中的作用。
　　 方法：本研究構(gòu)建攜帶含有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)報告基因的大鼠microRNA-124a慢病毒載體,將其感染至大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),并傳代,采用法舒地爾誘導(dǎo)大鼠MSCs分化

12、為神經(jīng)細(xì)胞。并于倒置熒光顯微鏡下觀察MSCs感染后的熒光表達(dá)情況;采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和western印跡檢測神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)、神經(jīng)微絲蛋白(NF200)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)變化,MTT方法檢測細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)染色法感染組誘導(dǎo)1h后,NSE、NF200的表達(dá)率分別為83.2±2.0％,79.6±0.4％,顯著高于其它兩組(P＜0.05)。各組GFAP的表達(dá)率都小于5％,無顯著性差異。

13、
　　 Western Blot結(jié)果三組分別誘導(dǎo)分化1h后均表達(dá)NSE、NF200,未感染組和陰性對照組無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異,而感染組表達(dá)的NSE、NF200較其它兩組明顯增高,有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)Rho/Rho激酶(ROCK)抑制劑法舒地爾可以在體外快速,高效的誘導(dǎo)大鼠MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。
　　 2.本研究首次報道TRPM8這種神經(jīng)細(xì)胞特殊蛋白MSCs分化為神經(jīng)細(xì)胞中出現(xiàn)表