外源性IL-12對絨癌JEG-3細(xì)胞增殖、侵襲及周期時相的影響.pdf

1、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞疾病(gestationaltrophoblasticdisease,GTD)是一組罕見的滋養(yǎng)葉組織疾病,可以看作是起源于浸潤母體(胞衣)組織受孕的同種異體移植物,具有獨(dú)特的形態(tài)學(xué)和臨床生物學(xué)行為,主要包括葡萄胎、侵襲性葡萄胎、絨毛膜癌和胎盤部位滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤。其中,絨毛膜癌(簡稱絨癌)是唯一由細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層共同組成的高度惡性腫瘤。滋養(yǎng)細(xì)胞的異常增殖和高度侵襲可以導(dǎo)致絨癌的發(fā)生,而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetal

2、loproteases,MMPs)及其抑制劑(tissueinhibitorsofmetalloproteases,TIMPs)作為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)降解的關(guān)鍵因子參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　白介素-12(interleukin-12,IL-12)是由巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞等抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子,主要介導(dǎo)T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)過程,同時對腫瘤和感染性疾病具有治療作用。近年來,I

3、L-12由于其免疫調(diào)節(jié)功能及抗腫瘤活性成為靶向治療的熱點(diǎn),然而IL-12在絨癌中的研究報道罕見,因此,我們觀察IL-12在不同劑量及作用時間下對絨癌JEG-3細(xì)胞的增殖和周期時相的影響,同時檢測MMP-9及TIMP-1的表達(dá)情況,將會為絨癌的細(xì)胞因子療法奠定實驗基礎(chǔ),同時為絨癌的臨床早期治療開拓新的思路。
　　第一部分:外源性IL-12對絨癌JEG-3細(xì)胞體外增殖的影響及意義
　　目的:
　　以外源性IL-12預(yù)處理絨

4、癌JEG-3細(xì)胞,采用MTT比色法檢測JEG-3細(xì)胞的增殖活力,探討重組人IL-12對絨癌細(xì)胞活性的影響。
　　方法:
　　本文的研究對象為永生化的絨癌JEG-3細(xì)胞系。取指數(shù)生長期的JEG-3細(xì)胞按初始濃度為3×104/mL接種于96孔板,37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(hour,h)后換成無血清培養(yǎng)基使其繼續(xù)饑餓同步化24h;然后分別給予0μg/L,5μg/L,10μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg

5、/L,200μg/L的IL-12對JEG-3細(xì)胞進(jìn)行外源性干預(yù),48h終止培養(yǎng)并收獲細(xì)胞;同時,選擇5μg/L的IL-12預(yù)處理JEG-3細(xì)胞,分別培養(yǎng)0h、24h、36h、48h、72h,終止培養(yǎng)。每組設(shè)5個平行孔。采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞的增殖活力。
　　結(jié)果:
　　1.與空白對照組比較,以不同劑量IL-12處理JEG-3細(xì)胞后,細(xì)胞增殖率顯著降低(P<0.05);隨著作用濃度的升高,IL-12對JEG-3細(xì)胞增殖的

6、抑制作用呈下降趨勢,5μg/L的IL-12對JEG-3細(xì)胞抑制作用最強(qiáng)。
　　2.隨著IL-12作用時間的延長,細(xì)胞的增殖活力明顯降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　外源性IL-12能夠抑制絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞的增殖,具有良好的濃度和時間依賴效應(yīng)。
　　第二部分:外源性IL-12對絨癌JEG-3細(xì)胞侵襲相關(guān)分子MMP-9、TIMP-1mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　目的:
　　探討外源性IL-12

7、對絨癌JEG-3細(xì)胞侵襲相關(guān)分子MMP-9和TIMP-1的表達(dá)情況。
　　方法:
　　以3×104/mL細(xì)胞濃度將JEG-3細(xì)胞接種到6孔板,培育48小時后饑餓同步化24小時,加入不同濃度的人重組IL-12,即終濃度分別為0μg/L(對照組),5μg/L,10μg/L,25μg/L,50μg/L,100μg/L,200μg/L,共溫育48h后終止培養(yǎng);同時觀察IL-12的不同處理時間對細(xì)胞的影響,用5μg/LIL-12處理J

8、EG-3細(xì)胞,分別培育0h、24h、36h、48h和72h后終止培養(yǎng),每組設(shè)5個平行孔。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction,RT-PCR)和蛋白印跡法(WesternBlotting)檢測各組MMP-9、TIMP-1mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.與對照組比較,IL-12各濃度處理組JEG-3細(xì)胞的MMP-9mRNA和蛋白的表達(dá)量均下

9、降(P<0.05),然而隨著濃度的升高,IL-12對MMP-9的下調(diào)能力減弱(P<0.05);TIMP-1mRNA與蛋白的表達(dá)則與MMP-9呈現(xiàn)相反趨勢(P<0.05)。
　　2.隨著IL-12作用時間的延長,JEG-3細(xì)胞MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.05),TIMP-1的表達(dá)呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　外源性IL-12可能通過下調(diào)MMP-9及上調(diào)TIMP-1的表達(dá)水平從而

10、抑制絨癌JEG-3細(xì)胞的侵襲能力。
　　第三部分:外源性IL-12對絨癌JEG-3細(xì)胞周期時相的影響
　　目的:
　　觀察外源性IL-12對絨癌JEG-3細(xì)胞周期的影響。
　　方法:
　　以3×104/mL的細(xì)胞濃度將JEG-3細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶,細(xì)胞貼壁48h,饑餓同步化24h后,加入不同濃度的重組人IL-12,即終濃度分別為0μg/L(對照組),5μg/L,10μg/L,25μg/L,50μg/L,100

11、μg/L,200μg/L,各劑量組均溫育48h和72h后終止培養(yǎng)。每組設(shè)5次獨(dú)立實驗。采用流式細(xì)胞術(shù)(FlowCytometry)檢測JEG-3細(xì)胞的周期時相變化。
　　結(jié)果:
　　與對照組比較,IL-12各處理組在48h和72h均觀察到細(xì)胞在G2期比例下降,細(xì)胞周期發(fā)生阻滯(P<0.05)。48h后,細(xì)胞周期主要阻滯在S期(P<0.05),而72h后,S和G1期均發(fā)生阻滯(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　IL