HBx基因缺失突變體(HBx-d382)對L02細胞增殖的影響及其相關機制探討.pdf

1、目的：原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是來源于肝細胞的惡性腫瘤，是世界上最常見的惡性腫瘤之一。流行病學研究表明慢性乙型肝炎病毒感染和原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，幾乎所有HBV(hepatitis B virus)相關的肝癌組織中可以檢測到基因組整合的HBV DNA。在眾多病毒基因組整合亞單位中HBx(Hepatitis B virus X gene)基因可以轉錄并翻譯成相應HBx蛋白，其與肝癌

2、的關系被廣泛研究。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在肝癌組織的基因組中廣泛存在HBx基因的整合和突變，并篩選出2個缺失突變體HBx-d382(HBx基因nt382-400缺失突變)和HBx-d431，其中HBx-d382在肝癌組織中檢出率較高，我們猜想HBx-d382可能與肝細胞癌密切相關，隨后我們成功構建了HBx-d382真核表達載體pcDNA3.0/HBx—d382。本研究將建立穩(wěn)定表達HBx基因缺失突變體(HBx—d382)的L02肝細胞株L02

3、/HBx-d382，探討HBx-d382對L02細胞增殖，G1期細胞周期調控及microRNA表達譜的影響。
　　 方法：含HBx-d382的重組質粒(pcDNA3.O/HBx-d382)經過PCR(Polymerasechain reaction)擴增、雙酶切及DNA測序鑒定后，通過脂質體轉染和G418篩選獲得穩(wěn)定表達HBx-d382的L02肝細胞株，PCR鑒定L02細胞基因組中HBx-d382基因整合，RT-PCR(Reve

4、rse transcription polymerase chain reaction)和western blot鑒定其表達。通過MTT法，軟瓊脂克隆形成實驗檢測HBx-d382對L02細胞增殖及非錨定依賴生長能力的影響，用流式細胞儀檢測其對細胞周期的影響；通過real-time定量PCR及western-blot鑒定轉染HBx—d382后L02細胞cyclin D1，cylinG1，E2F1表達改變；通過microRNA芯片技術檢測H

5、Bx-d382對L02細胞miRNA(microRNA)表達譜的影響。
　　 結果：(1)經PCR、酶切及測序鑒定HBx-d382重組質粒構建正確。(2)穩(wěn)定轉染該質粒的L02細胞基因組存在HBx-d382整合，RT-PCR及Westem-blot表明在RNA水平和蛋白水平存在HBx-d382表達。(3)MTT及軟瓊脂克隆形成實驗結果表明穩(wěn)定表達HBx-d382的L02細胞其增殖能力和非錨定生長能力增強，細胞周期檢測證實轉染HB

6、x-d382的L02細胞S+G2期細胞比例升高。(4)real-time定量PCR結果表明與轉染空質粒pcDNA3.0的L02細胞(L02/pcDNA3.0)相比L02/HBx-d382細胞cyclin D1，cylin G1，E2F1的mRNA表達明顯增強(P<0.05)；western-blot結果證實與102/pcDNA3.0細胞相比L02/HBx-d382細胞cyclin D1，cylin G1，E2F1蛋白表達明顯增強(p<0

7、.05)(5)microRNA芯片發(fā)現(xiàn)與L02/pcDNA3.0組細胞相比L02/HBx-d382組細胞mir-1，mir-338—3p，mir-551b，miR-455-3p，miR-200c表達下調，miR-501，miR-595，miR-1307，miR-1180，miR-497，miR-1246，miR-623表達上調。
　　 結論：本研究成功的構建了HBx基因缺失突變體(HBx-d382)的真核表達模型，證實HBx-d