癌胚抗原對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)展作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、第一部分:癌胚抗原受體在消化系統(tǒng)各器官的表達(dá)及意義
　　目的:研究癌胚抗原受體(CEAR)在消化器官主要組織細(xì)胞中的表達(dá)并探討其腫瘤學(xué)意義。
　　方法:以健康雄性BALB/c小鼠20只為研究對(duì)象，以免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)食管、胃、小腸、結(jié)腸、胰、肝等器官組織中的CEAR表達(dá)情況，并以酶消化和密度梯度離心的方法提取分離肝臟Kupffer細(xì)胞，采用細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)CEAR表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1) CEAR在消化管黏

2、膜上皮的胞質(zhì)和胞核均有表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度在食管黏膜上皮為弱陽(yáng)性，在胃、小腸黏膜上皮為中等程度陽(yáng)性，在結(jié)腸黏膜上皮為強(qiáng)陽(yáng)性，以結(jié)腸絨毛上皮及腺體開(kāi)口處黏膜上皮為最強(qiáng);在食管、胃、小腸、結(jié)腸平滑肌中為中等稍弱強(qiáng)度的陽(yáng)性表達(dá)，位置主要在胞質(zhì);而黏膜下層纖維組織及外膜未見(jiàn)明顯表達(dá)。與臨床上消化管腫瘤CEA陽(yáng)性率:結(jié)腸癌＞胃癌＞食管癌的規(guī)律一致。(2) CEAR在胰腺胰島中幾乎所有細(xì)胞呈中等強(qiáng)度陽(yáng)性表達(dá)，位置在胞核和胞質(zhì);而在胰腺外分泌部的腺泡、閏管

3、、外膜均未見(jiàn)明顯表達(dá)。與臨床上胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞瘤CEA陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于胰腺癌的臨床現(xiàn)象一致。(3) CEAR在肝臟中主要在肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞的胞質(zhì)呈中等強(qiáng)度的陽(yáng)性表達(dá)，而血竇內(nèi)皮及肝臟外膜未見(jiàn)明顯表達(dá)。與原發(fā)性肝癌CEA陽(yáng)性率較結(jié)腸癌低、結(jié)腸癌癌易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的臨床現(xiàn)象一致。(4) CEAR在全部陽(yáng)性細(xì)胞中表達(dá)位置（P＜0.01）和表達(dá)強(qiáng)度（P＜0.01）均存在顯著差異。這種廣泛而差異化的表達(dá)為CEA/CEAR途徑對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行普遍的差

4、異化功能調(diào)控提供了條件。
　　結(jié)論:CEAR在消化器官主要組織細(xì)胞的表達(dá)具有廣泛而差異化的特點(diǎn)，與消化器官CEA陽(yáng)性腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，尤其對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移可能有重要作用，內(nèi)在機(jī)制有待研究。
　　第二部分:癌胚抗原陽(yáng)性結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定
　　目的:構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)的小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株。
　　方法:以重組CEACAM5-eGFP-cDNA慢

5、病毒和重組eGFPcDNA慢病毒分別轉(zhuǎn)染鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞，抗生素篩選2w，以有限稀釋法獲得CEA陽(yáng)性細(xì)胞單克隆，體外培養(yǎng)至第7代和第14代進(jìn)行鑒定。以野生型CT26細(xì)胞為對(duì)照，用熒光顯微鏡和免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察CEACAM5表達(dá)位置，用RT-PCR法對(duì)CEACAM5 mRNA表達(dá)進(jìn)行鑒定，用western blot法對(duì)CEACAM5蛋白表達(dá)進(jìn)行鑒定，用ELISA法檢測(cè)CEACAM5蛋白產(chǎn)量。以第14代CT26CEA細(xì)胞及第12代CT2

6、6細(xì)胞分別建立BALB/c鼠皮下種植瘤模型，體內(nèi)傳代至第5代，用活體熒光成像法和免疫組織化學(xué)法對(duì)瘤體CEACAM5表達(dá)進(jìn)行鑒定，用ELISA法檢測(cè)小鼠血漿CEACAM5蛋白濃度。
　　結(jié)果:(1)獲得有明亮綠色熒光的單克隆CT26CEA細(xì)胞株及熒光對(duì)照CT26GFP細(xì)胞株。(2)第7代、第14代CT26CEA細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)融合蛋白發(fā)出的明亮綠色熒光，而CT26細(xì)胞未見(jiàn)熒光。(3)第7代、第14代CT26CEA細(xì)

7、胞免疫化學(xué)檢測(cè)呈陽(yáng)性，位置在細(xì)胞質(zhì)，呈黃色或淺棕色，而CT26細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)呈陰性。(4)第7代、第14代CT26CEA細(xì)胞總RNA中均檢測(cè)到CEACAM5 mRNA表達(dá)，而CT26細(xì)胞則未檢測(cè)到CEACAM5mRNA表達(dá)。(5)在第7代、第14代CT26CEA細(xì)胞裂解液中可檢測(cè)到CEACAM5蛋白表達(dá)，而CT26細(xì)胞則未檢測(cè)到CEACAM5蛋白表達(dá)。(6)第7代、第14代CT26CEA細(xì)胞體外培養(yǎng)24h CEA產(chǎn)量分為265±71n

8、g/106cell和，213±66ng/106cell，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(7)兩株細(xì)胞皮下注射法均可使小鼠致瘤，14d成瘤率為100％(n=8)。經(jīng)體內(nèi)傳代至第5代，致瘤率均為100％(n=8)。所有CEACT26皮下瘤可在藍(lán)色光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，免疫組化檢測(cè)CEA均呈陽(yáng)性，表達(dá)位置主要在細(xì)胞質(zhì)，而CT26皮下瘤未見(jiàn)無(wú)熒光，免疫組化染色呈陰性。CEACT26細(xì)胞株建立的第1代荷瘤小鼠14d血清CEA濃度與第5代荷瘤小鼠相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義，但均顯著高于CT26細(xì)胞株荷瘤小鼠(P＜0.01)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建小鼠結(jié)腸癌CT26CEA細(xì)胞株，能夠在體外培養(yǎng)及小鼠體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)CEA，為研究CEA對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及對(duì)小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌進(jìn)展的影響提供了便利研究工具。
　　第三部分:內(nèi)生性癌胚抗原對(duì)結(jié)腸癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:研究?jī)?nèi)生性癌胚抗原對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞粘附、遷移、侵襲、增殖、凋亡等生物學(xué)特性的影響及對(duì)小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的

10、影響。
　　方法:以野生型CT26細(xì)胞株、前期構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)CEA的CT26CEA細(xì)胞株和僅表達(dá)熒光蛋白的CT26GFP細(xì)胞株為研究對(duì)象，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞粘附能力，用transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力及侵襲能力，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布、計(jì)算增殖指數(shù)和凋亡指數(shù)，用MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間。進(jìn)一步建立BALB/c小鼠皮下種植瘤模型，比較14d致瘤率和瘤體質(zhì)量，以末端標(biāo)記法(Tunel法)檢測(cè)皮下種植瘤細(xì)

11、胞凋亡情況，并用脾臟注射法建立BALB/c小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型，比較肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率及轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)。
　　結(jié)果:(1)CT26CEA細(xì)胞株與CT26GFP細(xì)胞株相比，黏附能力提高14.7％（P＜0.01），遷移能力提高21.8％（P＜0.01），侵襲能力提高39.5％(P＜0.01)，而CT26GPF細(xì)胞株與CT26細(xì)胞株相比，粘附、遷移及侵襲能力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)三株細(xì)胞周期分布、增殖指數(shù)、凋亡指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(3)三株細(xì)

12、胞體外生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞群體倍增時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)三株細(xì)胞皮下種植瘤14d成瘤率均為100％，但CT26CEA細(xì)胞株與CT26GPF細(xì)胞株相比，成瘤更早(P＜0.05)，瘤體質(zhì)量更大(P＜0.01);三株癌細(xì)胞瘤體內(nèi)凋亡指數(shù)均小于4％，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)三株細(xì)胞脾臟種植瘤模型肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率無(wú)顯著差異，但CT26CEA細(xì)胞株與CT26GPF細(xì)胞株相比，肝轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)顯著增多（P＜0.01）。
　　結(jié)論:內(nèi)生性癌胚抗原可以促進(jìn)