內(nèi)皮抑素不同給藥途徑聯(lián)合阿霉素治療鼠H22肝移植瘤研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 肝癌(liver caricer)是常見惡性腫瘤之一,主要分布在亞洲太平洋沿岸及非洲的東南部地區(qū)。據(jù)世界衛(wèi)生組織2005年全球腫瘤統(tǒng)計分析表明,目前每年新患肝癌人數(shù)為62.6萬,死亡59.8萬人,我國肝癌占全世界40％～55％,診治形勢十分嚴峻。近年來,隨著對肝癌早期診斷和治療手段的進步,使肝癌患者的5年生存率有所提高。盡管關于肝癌的治療研究取得了較大進展,新技術和新方法也層出不窮,但對肝癌仍缺乏有效的治

2、療手段,治療肝癌的研究工作仍十分緊迫。
　　 近年來人們開始研究通過抑制肝腫瘤血管的生成,來達到抑制腫瘤的目的。發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移與新生血管生成有著密切聯(lián)系。腫瘤細胞通過新生血管獲取營養(yǎng)和氧氣,也通過新生血管向身體的遠處部位轉(zhuǎn)移。如果能切斷供應腫瘤生長的血管,理論上能夠餓死腫瘤細胞,并且阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前已發(fā)現(xiàn)能促進血管生成的因子主要有:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、血管生成素(angioge

3、nin)、表皮生長因子(EGF)等；而與之作用相反的抑制血管生成的因子主要包括:血管抑素(vascular inhibition)、內(nèi)皮抑素(Endostatin)、凝血酶敏感蛋白21(thrombospondin21)、血小板因子24(platelet factor24)等。在正常情況下,新生血管生成主要在組織再生、女性黃體生成期及孕期發(fā)生。內(nèi)皮抑素作為抑制腫瘤血管生長因子之一,最初是從鼠成血管細胞瘤株培養(yǎng)液中分離提純得到的一種20k

4、D的內(nèi)源性糖蛋白,能特異性地作用于新生血管內(nèi)皮細胞生長的一種抑制因子,通過對其N端18個氨基酸序列測定,發(fā)現(xiàn)該因子是膠原XⅧ因子羧基末端水解片段,在小鼠中對腫瘤誘導的血管生成幾乎具有完全的抑制作用,能直接抑制內(nèi)皮細胞的增殖、轉(zhuǎn)移并誘導其凋亡而發(fā)揮其抗血管生成的作用,顯示出很強的抗腫瘤活性。近年來對內(nèi)皮抑素直接抑制某些腫瘤細胞生長和侵襲轉(zhuǎn)移的研究也有了初步的報道。
　　 美國Entremed公司曾經(jīng)采用酵母作為表達體系來生產(chǎn)內(nèi)皮抑

5、素,1999年、2002年先后對內(nèi)皮抑素進行了I期及Ⅱ期的臨床實驗研究,但由于內(nèi)皮抑素體外的不穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本高等因為,使其停滯于Ⅱ期臨床試驗。我國江蘇先聲藥業(yè)采用大腸桿菌基因工程作為蛋白表達體系生產(chǎn)出來一種新型的內(nèi)皮抑素,其穩(wěn)定性,生物活性、產(chǎn)品純度有了較大的改善,并且其半衰期延長、生產(chǎn)成本降低并縮短了生產(chǎn)周期。在多項動物實驗中均顯示出其能有效的抑制內(nèi)皮細胞的增殖、血管生成及腫瘤生長的作用。內(nèi)皮抑素具有以下優(yōu)點:藥物較易接近內(nèi)皮細胞；

6、少量的內(nèi)皮細胞的損傷就可以使大量腫瘤細胞死亡,治療腫瘤具有廣譜性；內(nèi)皮抑素藥物具有低毒性,副反應較小；內(nèi)皮細胞基因穩(wěn)定,不容易突變,耐藥性比較低；抗新生血管生成治療可以增強腫瘤細胞對放、化療的敏感性。研究表明,單獨應用抗血管治療腫瘤作用有限。近年來,聯(lián)合抗血管治療已經(jīng)受到人們的廣泛關注,內(nèi)皮抑素聯(lián)合化療治療乳腺癌、肺癌等腫瘤模型已取得了較好的效果。在國內(nèi),臨床上已用于聯(lián)合長春瑞濱和順鉑方案治療初治或復治的Ⅲ/Ⅳ期非小細胞肺癌(NSCLC

7、)等,并取得了較好的療效,但對肝癌治療基礎研究尚不是很完善,尚需進一步研究。
　　 肝臟腫瘤血管具有豐富,扭曲的特點,在對血管豐富的肝癌實體瘤的治療方面,內(nèi)皮抑素可能起到積極的作用。內(nèi)皮抑素靜脈用于抗腫瘤血管生成治療要反復輸入高濃度藥物,在臨床應用上受到一定的限制。若能改變內(nèi)皮抑素給藥途徑,如瘤體內(nèi)給藥,提高腫瘤組織中的藥物濃度,可能會提高內(nèi)皮抑素的治療療效。因此,本課題采用建立昆明小鼠皮下肝癌移植腫瘤模型的方法,在聯(lián)合阿霉素化

8、療的基礎上,從抗血管生成和殺傷腫瘤細胞兩方面對肝癌的治療進行研究,觀察其對昆明小鼠肝移植瘤的抑制和殺傷作用,探討內(nèi)皮抑素治療肝癌的價值。并進一步觀察在聯(lián)合化療藥基礎上,內(nèi)皮抑素瘤內(nèi)給藥及靜脈給藥的抑瘤效果及對小鼠生存期的影響,為內(nèi)皮抑素治療肝癌研究提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 第一部分 將H22鼠源性肝癌細胞接種到40只18～22g昆明種小鼠的背部皮下,待接種腫瘤直徑約1cm左右時,將40只昆明小鼠隨機分成4組:(1

9、)對照組:隔日尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml+腹腔注射生理鹽水0.1 ml:(2)聯(lián)合用藥組:隔日尾靜脈推注內(nèi)皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1ml；(3)內(nèi)皮抑素組:隔日尾靜脈推注內(nèi)皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射生理鹽水0.1 ml；(4)阿霉素組:隔同腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1 ml+尾靜脈注射生理鹽水0.1 ml；共給藥14 d。每組取5只昆明小鼠,每3天測量皮下腫

10、瘤直徑,繪制腫瘤生長曲線,比較各組的抑瘤率,檢測血漿 VEGF 濃度、腫瘤組織微血管密度(MVD),每組剩余5只小鼠正常飼養(yǎng)觀察其中位生存期。
　　 第二部分 將鼠源性H22肝癌細胞接種到40只昆明種小鼠的背部皮下,腫瘤直徑約1cm時按體重將40只小鼠隨機分成4組:(1)對照組:隔日瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1 ml+腹腔注射生理鹽水0.1 ml；(2)內(nèi)皮抑素瘤內(nèi)組:隔同瘤內(nèi)注射內(nèi)皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素

11、1 mg/kg 0.1 ml；(3)內(nèi)皮抑素靜脈組:隔R尾靜脈推注內(nèi)皮抑素10 mg/kg 0.1 ml+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1m]；(4)阿霉素組:隔R尾靜脈推注生理鹽水0.1 m1+腹腔注射阿霉素1 mg/kg 0.1ml。每3天測量皮下腫瘤直徑,繪制腫瘤生長曲線,比較各組的抑瘤率,第15天每組處死5只小鼠,檢測血漿VEGF含量、腫瘤組織MVD,觀察每組剩余5只小鼠的中位生存期。
　　 結果
　　 第一

12、部分 治療結束后,聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤體積顯著小于其它各組,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),血漿VEGF水平及瘤組織中MVD表達較其他各組顯著減低,有統(tǒng)計學差異(P<0.05),且生存時間較其他各組顯著延長,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；但內(nèi)皮抑素組血漿VEGF水平與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 第二部分 內(nèi)皮抑素瘤內(nèi)組小鼠腫瘤體積大小、血漿VEGF水平及腫瘤組織MVD均小于其他3組,有顯著性差異(P<0.05),

13、內(nèi)皮抑素瘤內(nèi)組及內(nèi)皮抑素靜脈組小鼠生存期均較阿霉素組、對照組延長,組間有顯著性差異(P<0.05),但內(nèi)皮抑素瘤內(nèi)組及內(nèi)皮抑素靜脈組二者之間生存期無顯著性差異(P>0.05)。
　　 結論
　　 1、內(nèi)皮抑素聯(lián)合阿霉素抑制小鼠肝腫瘤作用優(yōu)于內(nèi)皮抑素單藥治療或阿霉素單藥治療,二者具有協(xié)同效應；聯(lián)合治療組能顯著延長荷瘤小鼠中位生存期。
　　 2、在聯(lián)合阿霉素的基礎上,瘤內(nèi)局部應用內(nèi)皮抑素較靜脈全身應用內(nèi)皮抑素對昆明小