核激素受體在皮膚主要構(gòu)成細胞和表皮鱗癌A431細胞中的表達及其部分配體的調(diào)節(jié)效應(yīng).pdf

1、研究背景與目的:
　　核激素受體(nuclearhormonereceptor,NHR)超家族是目前已知的最大的一類真核轉(zhuǎn)錄因子家族。近十年來,該家族的成員以驚人的速度從各類動物中鑒定和發(fā)現(xiàn),使得核受體超家族的結(jié)構(gòu)和功能成為分子生物學(xué)研究的熱點之一。核受體超家族由共同的祖先進化演變而來,具有共同的結(jié)構(gòu)特征。通過與特定的應(yīng)答元件的識別和結(jié)合,對靶基因的轉(zhuǎn)錄進行調(diào)控,在生物體的發(fā)育、分化以及體內(nèi)平衡穩(wěn)定等多種生理活動中發(fā)揮重要作用。配

2、體激活的核激素受體在核內(nèi)與DNA結(jié)合,調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的表達。它們在保持多種細胞和組織,包括皮膚的穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　核激素受體超家族的成員數(shù)量之多遠遠超出了人們當(dāng)初的預(yù)料。到目前為止,已經(jīng)超過了150個,使得這一超家族成為目前已知的最大的一類真核轉(zhuǎn)錄因子家族。不僅包括已發(fā)現(xiàn)配基的鹽皮質(zhì)激素受體(Mineralocorticoidreceptor,MR)、糖皮質(zhì)激素受體(GlucocorticoidReceptor,GR)、孕

3、酮受體(Progesteronereceptor,PR)、雄激素受體(Androgenreceptor,AR)、雌激素受體(EstrogenReceptor,ER)、甲狀腺素受體(Thyroidhormonereceptor,TR)、維生素D3受體(VitaminD3receptor,VDR)和維甲酸受體(RAR和RXR),還包括大量的配基未知的孤兒受體(orphanreceptors)。
　　核激素受體在調(diào)節(jié)皮膚發(fā)育過程中發(fā)揮重

4、要作用,它們還參與調(diào)節(jié)細胞代謝,增殖、分化、細胞凋亡和炎癥過程等。關(guān)于糖皮質(zhì)激素、雄激素以及雌激素受體對皮膚的作用已進行廣泛研究。隨著研究深入,發(fā)現(xiàn)核激素受體的其他很多成員在維持皮膚平衡方面也發(fā)揮了重要作用。其中一組與RXR形成異源二聚體的亞群受體中,多種受體(比如RAR和VDR)的配體已成功用于皮膚病的治療。不同的受體在皮膚中發(fā)揮不同作用,而且可以隨機的選取靶向藥物用于皮膚病的臨床治療。目前研究致力與確定更多的核激素受體亞群成員對皮膚

5、的作用,其中包括過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisomeproliferators-activatedreceptors,PPARs)、和肝X受體(LiverXreceptors,LXRs)。
　　通常情況下,膜受體與配體結(jié)合(如生長因子),啟動胞漿內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)。與膜受體不同的是,配體與其核受體結(jié)合后,可以將信號傳遞至核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄機器,但是其作用不僅僅局限在核內(nèi),它們也可以直接與胞漿內(nèi)的信號通路直接作用。最為特殊的一點是,膜

6、受體只一小部分的受體激活通過下游的級聯(lián)反應(yīng)就能產(chǎn)生最大的反應(yīng)強度,而核激素受體的受體占用率則通常與激素的反應(yīng)強度呈平行關(guān)系,即核激素受體的表達水平高低決定了相應(yīng)激素的作用效果,水平越高,則反應(yīng)強度越強,反之亦然。
　　人類皮膚中存在哪些核激素受體家族成員表達,且其表達水平如何?其相應(yīng)配體對正常皮膚功能會有何調(diào)節(jié)作用?核激素受體家族成員在正常皮膚表皮細胞與鱗狀細胞癌的表達之間是否存在差異?這種表達異常是否在皮膚惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過

7、程中發(fā)揮重要作用?高表達受體成員是夠能成為腫瘤治療的特異性靶點?針對上述問題,本實驗采用PCRarray方法檢測皮膚的主要組成細胞(表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞)以及皮膚鱗狀細胞癌細胞A431細胞系中核激素受體的表達水平以了解核激素受體各相關(guān)成員mRNA表達情況,并選取相應(yīng)的受體配體對A431腫瘤細胞進行藥物處理,觀察相應(yīng)配體對細胞增殖、分化以及細胞周期等細胞生理特性的影響。本研究旨在深入了解核激素受體在調(diào)控皮膚細胞功能以及腫瘤細胞

8、失控性過度增殖機制中的作用,并有助于尋找特異性靶點而為皮膚相關(guān)疾病提供潛在的治療藥物。
　　研究方法與結(jié)果:
　　1.應(yīng)用PCRarray方法分別檢測了核激素受體家族成員在皮膚主要構(gòu)成細胞-表皮角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞mRNA的表達水平,發(fā)現(xiàn)在皮膚主要構(gòu)成細胞中主要表達的核激素受體以RXR異構(gòu)二聚體家族成員為主,表皮角質(zhì)形成細胞內(nèi)核激素受體表達水平普遍高于真皮成纖維細胞。
　　2.外用甲狀腺素類似物-TRIAC處理

9、C57BL/6小鼠一周后,免疫組織化學(xué)方法結(jié)果提示TRIAC可明顯促進小鼠表皮細胞增殖,導(dǎo)致表皮厚度增加,但顯著降低皮膚表皮中細胞分化標(biāo)記物的表達水平。
　　3.MTS結(jié)果提示TRIAC可促進體外培養(yǎng)人正常角質(zhì)形成細胞增殖,Real-timePCR及WesternBlotting結(jié)果提示TRIAC可顯著促進角質(zhì)形成細胞內(nèi)增殖標(biāo)記物PCNA的表達水平升高,抑制細胞分化標(biāo)記物的表達;流式細胞術(shù)結(jié)果提示TRIAC可明顯促進體外培養(yǎng)角質(zhì)形

10、成細胞中G1期細胞比例降低,而S期細胞比例升高。
　　4.應(yīng)用PCRarray方法檢測皮膚鱗癌A431細胞中核激素受體的表達情況,提示皮膚鱗狀細胞癌細胞中也存在大量核激素受體表達,與正常角質(zhì)形成細胞相比,鱗狀細胞癌細胞中,部分RXR異構(gòu)二聚體家族成員mRNA表達水平明顯升高。
　　5.MTS結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種新合成的RXR二聚體家族配基中,LXR受體激動劑(T0901317和GW3965)可明顯抑制體外培養(yǎng)的皮膚鱗癌A431細胞增

11、殖。
　　6.流式細胞術(shù)結(jié)果提示LXR受體激動劑可導(dǎo)致A431細胞周期中G0/G1期細胞比例明顯升高,S期細胞比例顯著降低。
　　7.PCR結(jié)果和WesternBlotting結(jié)果提示LXR受體激動劑處理后,導(dǎo)致A431細胞中細胞增殖標(biāo)記物PCNA的表達水平明顯降低。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子KLF4表達水平明顯升高,其下游基細胞周期抑制因子p21表達水平明顯升高。
　　8.應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默A431細胞中LXRβ受體后,再次LX

12、R受體激動劑處理干擾后細胞,PCR結(jié)果提示LXR受體激動劑對相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用明顯減弱。
　　結(jié)論:
　　正常皮膚角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞中都存在大量核激素受體家族成員的表達,其中以RXR異構(gòu)二聚體亞家族成員為主。表皮是核激素受體表達的主要部位,提示表皮細胞可能是核激素受體作用的重要靶細胞。作為RXR異構(gòu)二聚體亞家族的重要一員,甲狀腺素類似物可明顯促進表皮細胞增殖,顯著抑制表皮細胞分化。
　　皮膚鱗狀細胞癌細胞中也存在