cAMP信號(hào)通路介導(dǎo)全麻藥遺忘和睡眠損害效應(yīng).pdf

1、環(huán)磷酸腺苷(cAMP或cyclic AMP，3'-5'-cyclic adenosine monophosphate)作為胞內(nèi)第二信使，主要負(fù)責(zé)傳遞G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR，G-protein coupled receptor)信號(hào)。cAM由腺苷酸環(huán)化酶(AC，adenylyl cyclase)分解ATP產(chǎn)生，通過磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase）降解。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，cAMP能夠通過蛋白激酶A（PKA，prote

2、in kinase A）-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB，cAMP responseelement-binding protein）、環(huán)核苷酸控制的離子通道（CGN channels，cyclicnucleotide-gated channels，特別是超極化激活的CGN通道(HCN通道，hyperpolarization-activated CGN channels)）和cAMP活化的交換蛋白(Epac，exchangeprote

3、in directly activated by cAMP)等信號(hào)通路，參與學(xué)習(xí)記憶、睡眠和晝夜節(jié)律調(diào)控等多種功能。靜脈全麻藥異丙酚和吸入性全麻藥異氟烷和七氟烷均能夠調(diào)節(jié)中樞和外周GPCR/G蛋白/cAMP信號(hào)通路。本課題擬研究調(diào)控腦cAMP信號(hào)通路對(duì)全麻藥導(dǎo)致的遺忘和睡眠損害效應(yīng)的影響。
　　 第一部分cAMP/CREB通路介導(dǎo)異丙酚對(duì)空間記憶鞏固的損害
　　 目的:靜脈全麻藥異丙酚(propofol)在低于麻醉濃度時(shí)

4、，即可損害情景記憶的鞏固,導(dǎo)致順行性遺忘，而對(duì)記憶編碼和短時(shí)記憶無明顯影響。情景記憶為人類獨(dú)有，包含了事件(what)、時(shí)間(when)、地點(diǎn)(where)、情緒(emotion)和背景環(huán)境(context)等要素。大鼠空間記憶模型(Morris水迷宮，non-cued MWM)能夠模擬情景記憶的事件和地點(diǎn)要素，被稱為“類情景記憶”(episodic-like memory)。本研究假設(shè)一:與臨床研究相似，鎮(zhèn)靜劑量的異丙酚能夠選擇性損害

5、大鼠空間記憶鞏固，而對(duì)空間學(xué)習(xí)和短時(shí)記憶無影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠空間記憶的鞏固依賴于海馬cAMP/CREB信使系統(tǒng)。假設(shè)二:異丙酚損害空間記憶鞏固的同時(shí)，抑制了海馬cAMP/CREB通路。假設(shè)三:選擇性磷酸二酯酶-4(PDE-4)抑制劑rolipram能夠通過抵消異丙酚對(duì)cAMP/CREB通路的抑制，逆轉(zhuǎn)異丙酚的遺忘效應(yīng)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為四組:C（賦形劑對(duì)照組）;P（異丙酚組，25 mg/kg，腹腔注射）;R(rolip

6、ram組，0.3 mg/kg，腹腔注射);R+P(rolipram聯(lián)合異丙酚組，異丙酚注射前25分鐘注射rolipram)。實(shí)驗(yàn)一:為排除異丙酚和rolipram的鎮(zhèn)靜效應(yīng)對(duì)異丙酚遺忘的影響，分別在異丙酚注射后5、15和25分鐘測(cè)定了大鼠的鎮(zhèn)靜/麻醉評(píng)分。實(shí)驗(yàn)二:為排除運(yùn)動(dòng)能力對(duì)異丙酚遺忘的影響，分別在異丙酚注射后5、15和25分鐘，采用轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)測(cè)定了大鼠的運(yùn)動(dòng)技巧和協(xié)調(diào)能力。實(shí)驗(yàn)三:為排除非空間因素（運(yùn)動(dòng)能力、恐懼感、工作記憶等）對(duì)大

7、鼠空間記憶和異丙酚遺忘的影響，在異丙酚注射后5分鐘和24小時(shí)實(shí)施顯露平臺(tái)的水迷宮實(shí)驗(yàn)(cued MWM)。實(shí)驗(yàn)四:空間學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)(non-cued MWM)和cAMP/CREB通路活化情況測(cè)定。在異丙酚注射后5分鐘行定位航行訓(xùn)練（隱藏平臺(tái)實(shí)驗(yàn)），測(cè)定空間學(xué)習(xí)和短時(shí)空間記憶情況;在異丙酚注射后24小時(shí)，行空間探索實(shí)驗(yàn)，測(cè)定長(zhǎng)時(shí)間記憶水平，以反映空間記憶鞏固情況。在異丙酚注射后5分鐘、50分鐘和24小時(shí)測(cè)定海馬cAMP/CREB通路活化情

8、況，包括cAMP水平;ERK1/2、AKT、CaMKⅡα和CREB磷酸化活化程度;CaMKIV、BDNF、c-Fos和Arc蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:與對(duì)照組相比，異丙酚25 mg/kg注射后，大鼠表現(xiàn)出部分鎮(zhèn)靜效應(yīng)。rolipram預(yù)注射對(duì)異丙酚的鎮(zhèn)靜效應(yīng)無影響。實(shí)驗(yàn)二:異丙酚和rolipram均不損害大鼠的運(yùn)動(dòng)能力。實(shí)驗(yàn)三:異丙酚對(duì)非空間記憶無影響。異丙酚注射后5分鐘和24小時(shí)的顯露平臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠潛伏期無統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)四:異丙酚不損害空間學(xué)習(xí)和短時(shí)記憶能力，但損害空間記憶鞏固。預(yù)先注射rolipram能夠?qū)巩惐拥倪z忘效應(yīng)。與對(duì)照組相比，異丙酚注射后海馬cAMP水平降低，CREB和CaMKⅡα磷酸化水平降低，BDNF、Arc蛋白表達(dá)下降。單獨(dú)注射rolipram增加cAMP水平，但對(duì)空間記憶和其他信號(hào)通路無影響。預(yù)先注射rolipram能夠?qū)巩惐訉?duì)cAMP/CREB通路的抑制。
　　 結(jié)論:異丙酚選擇性損害空間記憶鞏固，導(dǎo)致

10、順行性遺忘。cAMP/CREB通路可能介導(dǎo)了異丙酚的遺忘效應(yīng)。
　　 第二部分RGS/Gα12/cAMP通路介導(dǎo)吸入性全麻藥對(duì)睡眠的損害
　　 目的:術(shù)后睡眠障礙的發(fā)生率約為100％，主要表現(xiàn)為清醒次數(shù)增加，NREM睡眠時(shí)間減少，REM睡眠時(shí)間先抑制后反跳性增加，且伴隨有嚴(yán)重的晝夜節(jié)律紊亂。術(shù)后睡眠障礙嚴(yán)重影響手術(shù)療效，增加術(shù)后并發(fā)癥和死亡率。研究發(fā)現(xiàn)，全麻藥可能是術(shù)后睡眠障礙的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。不同于異丙酚，吸入性麻醉藥麻

11、醉后，小鼠REM睡眠反跳性增加。研究全麻藥導(dǎo)致睡眠障礙的相關(guān)機(jī)制，并探索相關(guān)的有效干預(yù)措施，可能有助于改善患者術(shù)后預(yù)后。不同于靜脈麻醉藥，異氟烷和七氟烷能夠作用于Gαi2/cAMP通路。RGS蛋白(regulators ofG protein signaling protein)作為GPCR信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，能夠通過加速降解GTP，抑制Gαi2/cAMP通路。此前研究發(fā)現(xiàn)RGS蛋白失敏感的Gαi2G184s小鼠對(duì)異氟烷更加敏感。異

12、氟烷麻醉后，該基因敲入小鼠翻正反射消失的時(shí)間縮短，恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)。本研究進(jìn)一步假設(shè)一:RGS蛋白對(duì)Gαi2/cAMP通路的抑制有助于維持正常的睡眠結(jié)構(gòu);假設(shè)二:RGS蛋白對(duì)Gαi2/cAMP通路的抑制參與了吸入麻醉導(dǎo)致的睡眠障礙。
　　 方法:研究采用了基因敲入(gene knock-in)的Gαi2G184s小鼠。該小鼠Gαi2蛋白第184位甘氨酸殘基(G)被突變?yōu)榻z氨酸殘基(S)后，失去與RGS蛋白結(jié)合的能力，導(dǎo)致RGS蛋白催

13、化活化型GTP-Gαi2轉(zhuǎn)變?yōu)榉腔罨虶DP-Gαi2的作用消失，即RGS失敏感的Gαi2亞單位G184S等位基因突變(RGS-insensitive G184S Gαi2 allele mutation)。Gαi2G184s基因敲入小鼠的Gαi2相關(guān)信號(hào)通路增強(qiáng)，即Gαi2持續(xù)抑制cAMP水平和Gβγ信號(hào)通路持續(xù)活化。實(shí)驗(yàn)一測(cè)定了野生型(WT)、雜合子Gαi2G184S基因敲入小鼠(+/GS)和純合子基因敲入小鼠(GS/GS)的24小

14、時(shí)基礎(chǔ)睡眠結(jié)構(gòu)，以確定RGS/Gαi2相互作用在維持正常睡眠中的作用。實(shí)驗(yàn)二觀察給予3小時(shí)異氟烷(1.3％)或七氟烷(2.8％)麻醉后18.5小時(shí)內(nèi)，三種基因型小鼠的睡眠結(jié)構(gòu)損害情況，以確定RGS/Gαi2是否參與了吸入性麻醉藥導(dǎo)致的睡眠紊亂。
　　 結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:WT小鼠和+/GS小鼠在24小時(shí)覺醒時(shí)間、NREM睡眠時(shí)間和REM睡眠時(shí)間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與WT小鼠相比，純合子GS/GS小鼠24小時(shí)NREM睡眠時(shí)間增加了13.95％

15、，而覺醒時(shí)間減少了11.85％。WT和GS/GS小鼠的覺醒/睡眠時(shí)間比例也不相同。與WT小鼠相比，GS/GS小鼠白晝時(shí)NREM睡眠和REM睡眠減少，而夜晚時(shí)NREM睡眠和REM睡眠增加。同時(shí)，GS/GS小鼠的NREM睡眠和覺醒維持存在障礙，表現(xiàn)為NREM睡眠和覺醒次數(shù)增加而平均每次持續(xù)時(shí)間下降。FFT功率密度譜分析發(fā)現(xiàn)，GS/GS小鼠覺醒和NREM睡眠期delta活動(dòng)(0.5-4 Hz)增加，而REM睡眠期theta活動(dòng)(5-8 Hz)

16、減少。以上結(jié)果提示RGS/Gαi2參與了小鼠正常睡眠結(jié)構(gòu)的維持。實(shí)驗(yàn)二:與對(duì)照組（純氧組）相比，異氟烷或七氟烷麻醉導(dǎo)致了深度睡眠結(jié)構(gòu)紊亂，主要表現(xiàn)為覺醒時(shí)間先增加后減少，NREM睡眠時(shí)間先減少后增加和REM睡眠反跳性增加。異氟烷或七氟烷麻醉時(shí)，WT小鼠恢復(fù)正常睡眠所需時(shí)間長(zhǎng)于GS/GS小鼠。NREM睡眠期delta活動(dòng)減少僅發(fā)生于WT和+/GS小鼠，而非GS/GS小鼠。以上結(jié)果提示RGS/Gαi2參與了吸入性全麻藥導(dǎo)致的睡眠結(jié)構(gòu)損害。<