STINg-IRF3信號(hào)通路介導(dǎo)血管和脂肪組織炎癥機(jī)制探索.pdf

1、研究背景:
　　血管并發(fā)癥是現(xiàn)在代謝綜合征病人的首要致死致殘因素。研究證明，內(nèi)皮細(xì)胞作為維持血管結(jié)構(gòu)和功能完整性的基本單元，其激活和炎癥狀態(tài)時(shí)血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要起始步驟。而代謝綜合征病人體內(nèi)升高的代謝壓力正是引起內(nèi)皮細(xì)胞激活的主要原因。但是迄今為止，內(nèi)皮細(xì)胞激活/炎癥的具體機(jī)制仍然不明確，所以研究代謝應(yīng)激下內(nèi)皮細(xì)胞激活/炎癥的機(jī)制對(duì)于未來開發(fā)血管并發(fā)癥防治措施有重要意義。
　　多種遺傳或環(huán)境因素參與了代謝綜合征的發(fā)生發(fā)

2、展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為外界刺激的感受器和放大器，調(diào)節(jié)了細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路的激活。生理情況下，細(xì)胞處于代謝穩(wěn)態(tài)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白Bip(Grp78)與ATF6、IRE1、PERK等激酶結(jié)合并抑制其活性。一旦給予細(xì)胞代謝壓力，UPR(Unfolded ProteinResponse)被激活，導(dǎo)致Bip與ATF6、IRE1、PERK等激酶脫離，進(jìn)而引起下游一系列應(yīng)激通路的激活。
　　線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的能量生成器，除了為機(jī)體合成ATP外，還

3、能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。線粒體DNA(mtDNA)是位于線粒體內(nèi)的含有37個(gè)線粒體基因的環(huán)狀DNA分子。由于mtDNA無內(nèi)含子和組蛋白，而且容易暴露于高水平的活性氧環(huán)境下，所以mtDNA突變頻率較核基因組高10倍以上。而且一旦線粒體膜完整性受到破壞，mtDNA易被釋放入細(xì)胞漿，進(jìn)而被DNA感受器識(shí)別，激活下游通路。
　　STING(stimulator of interferon genes， TMEM173)作為免疫和炎

4、癥中的一個(gè)重要信號(hào)分子，首先被認(rèn)為是病毒感染過程中宿主免疫反應(yīng)的重要分子。STING能夠識(shí)別病毒釋放到宿主胞漿內(nèi)的DNA，從而招募TBK1(Tank-binding kinase1)和轉(zhuǎn)錄因子IRF3(interferon regulatory factor)形成復(fù)合物，并移位至細(xì)胞核周圍。在此過程中IRF3被TBK1磷酸化，形成二聚體結(jié)構(gòu)并進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的IRF3與目的基因（IFNα，IFNβ等）的啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)炎癥基因的表

5、達(dá)。近期有報(bào)告表明STING-IRF3信號(hào)通路能夠被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)和線粒體損傷(mi tochondri al damage)激活，但其具體機(jī)制仍不明確。2014年新英格蘭雜志報(bào)道了一種發(fā)病于嬰兒期的STING相關(guān)血管病變(SAVI，STING-associated vasculopathy with onset ininfancy)，表現(xiàn)為STING過度激活伴隨內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。表明STING與內(nèi)皮細(xì)胞炎癥之間存在關(guān)聯(lián)。

6、
　　研究目的:
　　研究STING-IRF3信號(hào)通路在棕櫚酸(palmitic acid，PA)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥中發(fā)揮的作用;闡明IRF3調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的分子機(jī)制;探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷/mtDNA在PA誘導(dǎo)STING-IRF3信號(hào)通路激活中的作用;活體實(shí)驗(yàn)觀察STING-IRF3信號(hào)通路對(duì)代謝綜合征慢性炎癥的影響。
　　研究方法:
　　(1)棕櫚酸(PA)處理對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響:將棕櫚酸融入20％牛

7、血清白蛋白(BSA)溶液后制成0-4mM的PA儲(chǔ)存液(10X)。使用細(xì)胞培養(yǎng)基ECM將PA儲(chǔ)存液稀釋至終濃度(0-0.4mM)后處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間，用于后續(xù)試驗(yàn)。
　　(2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染:下調(diào)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)基因表達(dá)時(shí)，使用lipofectamine2000或Jetprime試劑盒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA6小時(shí)后給予后續(xù)處理。
　　(3)Western blot實(shí)驗(yàn):處理后細(xì)胞或速凍組織使用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解，確定

8、蛋白濃度后高溫變性。使用SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳，免疫印跡檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平。
　　(4)Real-time RT-PCR:處理后細(xì)胞使用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)ICAM-1 mRNA表達(dá)水平的改變。
　　(5)免疫熒光顯微技術(shù):細(xì)胞接種于含有細(xì)胞爬片的6孔板培養(yǎng)至相應(yīng)細(xì)胞密度，給予指定處理后進(jìn)行固定、封閉，然后依次加入一抗和二抗孵育，激光共聚焦顯微鏡觀察STING、IRF3等關(guān)

9、鍵分子在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。
　　(6)免疫共沉淀(Co-IP):未變性的全細(xì)胞裂解液去除非特異性結(jié)合后，加入STING或IRF3抗體過夜孵育后加入protein A+G agarose beads共同孵育，免疫沉淀產(chǎn)物變性后使用SDS-PAGE進(jìn)行凝膠電泳，免疫印跡檢測(cè)Bip是否與STING存在生理學(xué)上的相互作用。
　　(7)染色質(zhì)免疫共沉淀(Chip):細(xì)胞接種于10cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿并給予相應(yīng)處理后，使用1％多聚甲醛交聯(lián)后

10、給予SDS裂解，超聲粉碎，IRF3 pulldown和DNA提取后，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，比較IRF3與ICAM-1 promotor結(jié)合是否改變。
　　(8)動(dòng)物模型:野生型小鼠和STING缺陷小鼠分別給予三個(gè)月高脂飲食后安樂死、取材。使用OCT包埋脂肪組織，切片，進(jìn)行后續(xù)免疫熒光觀察。
　　(9)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.棕櫚酸能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞炎癥激活:
　

11、　(1)使用Western blot檢測(cè)，梯度棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)能夠明顯增加內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子ICAM-1蛋白水平。
　　(2)梯度棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)能夠明顯上調(diào)磷酸化IRF3的水平。
　　(3)病理劑量的棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)能夠觀察到明顯的STING向細(xì)胞核周圍移動(dòng)，并且伴隨IRF3移位至細(xì)胞核。
　　(4)梯度棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)能夠能夠明顯

12、增加內(nèi)皮細(xì)胞與人單核細(xì)胞細(xì)胞系THP-1細(xì)胞的粘附。
　　(5)使用Real-time RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示使用病理劑量的棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞6小時(shí)后，黏附分子ICAM-1 mRNA水平升高約2.5倍。
　　2.下調(diào)STING蛋白水平對(duì)STING-IRF3信號(hào)通路和內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot結(jié)果顯示下調(diào)STING表達(dá)可以顯著逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的IRF3磷酸化。
　　(2)

13、細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示下調(diào)STING表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的IRF3移位。
　　(3) Western blot結(jié)果顯示下調(diào)STING表達(dá)可顯著下調(diào)棕櫚酸誘導(dǎo)的ICAM-1蛋白高表達(dá)。
　　(4) Real-time RT-PCRR結(jié)果顯示下調(diào)STING表達(dá)可顯著下調(diào)棕櫚酸誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA高表達(dá)。
　　(5)單核細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)STING表達(dá)可以顯著減少內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附。
　　3.下調(diào)

14、轉(zhuǎn)錄因子IRF3蛋白水平對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子IRF3表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的ICAM-1蛋白水平升高。
　　(2) Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)IRF3表達(dá)能夠顯著逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的ICAM-1 mRNA水平升高
　　(3)分析ICAM-1基因啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示ICAM-1基因啟動(dòng)子內(nèi)有IRF3的結(jié)合位點(diǎn)。
　　(4)染色質(zhì)免

15、疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示棕櫚酸能夠誘導(dǎo)IRF3與ICAM--1啟動(dòng)子結(jié)合明顯增加，下調(diào)STING蛋白水平可顯著逆轉(zhuǎn)IRF3與ICAM-1啟動(dòng)子的結(jié)合。
　　(5)單核細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明下調(diào)IRF3蛋白水平能夠顯著逆轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附。
　　4.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與了棕櫚酸誘導(dǎo)的STING-IRF3通路激活:
　　(1) Western blot結(jié)果顯示棕櫚酸PA處理人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞能夠引起明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

16、。
　　(2) Western blot結(jié)果同樣確認(rèn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活劑毒胡蘿卜素/DTT能夠引起明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　(3)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明DTT處理內(nèi)皮細(xì)胞能夠引起明顯的STING核周移位和IRF3核移位。
　　(4) Western blot結(jié)果顯示毒胡蘿卜素/DTT處理內(nèi)皮細(xì)胞能夠引起明顯的IRF3磷酸化和ICAM-1蛋白水平升高。
　　5.Bip-STING相互作用介導(dǎo)了棕櫚酸引起的STING-IR

17、F3信號(hào)通路激活:
　　(1)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明正常內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)STING與Bip能夠相互結(jié)合。棕櫚酸、毒胡蘿卜素或DTT處理能夠減少兩者的相互結(jié)合。
　　(2)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明毒胡蘿卜素處理內(nèi)皮細(xì)胞可以引起STING脫離內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并與EEA1或TFR陽性囊泡結(jié)合，移位至細(xì)胞核周圍。
　　(3)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明下調(diào)Bip表達(dá)能夠明顯促進(jìn)STING向核周移位。
　　(4) Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示下調(diào)

18、Bip表達(dá)能夠明顯增加IRF3磷酸化及ICAM-1蛋白水平。
　　(5) Real Time RT-PCR結(jié)果確認(rèn)下調(diào)Bip表達(dá)能夠明顯上調(diào)ICAM-1的mRNA水平。
　　6.線粒體損傷和線粒體DNA釋放對(duì)于STING-IRF3信號(hào)通路激活的影響:
　　(1)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明棕櫚酸處理內(nèi)皮細(xì)胞后線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，胞漿內(nèi)雙鏈DNA(dsDNA)明顯增加。
　　(2)使用Real Time RT-PCR實(shí)驗(yàn)證

19、明，棕櫚酸處理內(nèi)皮細(xì)胞后，可以引起胞漿內(nèi)線粒體DNA數(shù)量顯著增加。
　　(3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用線粒體DNA處理內(nèi)皮細(xì)胞后能夠引起B(yǎng)ip-STING的結(jié)合減少。
　　(4)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明線粒體DNA處理內(nèi)皮細(xì)胞后能夠引起STING核周移位及IRF3核移位。
　　(5) Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明給予內(nèi)皮細(xì)胞線粒體DNA刺激，能夠引起IRF3磷酸化水平升高和ICAM-1蛋白水平升高。
　　

20、(6)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用線粒體損傷劑CCCP刺激細(xì)胞后，同樣能夠減少Bip-STING結(jié)合。
　　(7)細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明給予內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷劑CCCP或rotenone后，STING、IRF3同樣出現(xiàn)明顯移位。
　　7.胞漿DNA識(shí)別蛋白cGAS可能在棕櫚酸誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮作用。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，棕櫚酸能夠誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞cGAS(cGAMP合成酶)蛋白水平升高。同時(shí)下調(diào)cGAS表達(dá)能夠逆

21、轉(zhuǎn)棕櫚酸誘導(dǎo)的STING-IRF3信號(hào)通路激活和ICAM-1蛋白高表達(dá)。
　　8.在STING缺陷小鼠中證明STING-IRF3信號(hào)通路對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的影響:
　　(1) Western blot結(jié)果顯示高脂飲食能夠明顯上調(diào)脂肪組織內(nèi)IRF3磷酸化水平和ICAM-1蛋白水平;而STING缺陷能夠逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的IRF3磷酸化和ICAM-1高表達(dá)。
　　(2)組織免疫熒光結(jié)果顯示高脂飲食能夠誘導(dǎo)小鼠脂肪組織血管內(nèi)皮細(xì)

22、胞內(nèi)ICAM-1表達(dá)明顯增加，而STING缺陷能夠顯著減少ICAM-1的表達(dá)。
　　(3)組織免疫熒光結(jié)果顯示高脂飲食能夠誘導(dǎo)小鼠脂肪組織血管內(nèi)CD68+細(xì)胞浸潤增加，而STING缺陷能夠顯著減少CD68+細(xì)胞浸潤。
　　(4) HE染色結(jié)果顯示給予高脂飲食后小鼠脂肪組織中冠狀結(jié)構(gòu)(crown likestructure)明顯增加，而STING缺陷后能夠顯著逆轉(zhuǎn)冠狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量。
　　(5) Masson染色結(jié)果顯色高脂

23、飲食能夠誘導(dǎo)小鼠脂肪組織膠原沉積增加，而STING缺陷能夠顯著改善膠原沉積。
　　(6) STING缺陷能夠改善高脂飲食引起的體重增加、游離脂肪酸水平升高和胰島素抵抗。
　　結(jié)論:
　　(1)棕櫚酸能夠通過激活STING-IRF3信號(hào)通路誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥。
　　(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷/線粒體DNA釋放介導(dǎo)了棕櫚酸引起的STING-IRF3信號(hào)通路激活。
　　(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體損傷/線粒體DNA釋