SCID-Hu模型建立及循環(huán)血單核細(xì)胞對假體周圍組織形成的影響.pdf

1、研究背景：
　　 人工全關(guān)節(jié)置換術(shù)是治療終末期骨關(guān)節(jié)炎的有效手段，每年大約有100萬患者實(shí)施人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)，目前無菌松動(dòng)仍然是人工假體置換術(shù)后最常見的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，約20％的病人在10年內(nèi)發(fā)生骨溶解和假體松動(dòng)。對假體磨損研究表明：假體磨損產(chǎn)生數(shù)十億磨損顆粒，假體周圍組織細(xì)胞吞噬顆粒引起細(xì)胞因子釋放、激發(fā)炎癥反應(yīng)促使破骨細(xì)胞功能活化，最終導(dǎo)致骨溶解和無菌松動(dòng)。由于骨量是骨形成和骨丟失之間的動(dòng)態(tài)平衡來維持的，來自骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的成骨

2、細(xì)胞增加骨沉積增加骨量，來源單核巨噬細(xì)胞系的破骨細(xì)胞具有促進(jìn)骨吸收的作用。炎癥性細(xì)胞因子導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化而促使骨溶解。兩種調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成的重要因子分別是細(xì)胞核因子-κB受體活化因子(RANK)和細(xì)胞核因子-κB受體活化因子培基。RANK是RANKL的生物信號膜受體，屬于TNF受體超家族成員，在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、成熟破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞中表達(dá)，RANK同時(shí)出現(xiàn)在單核細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞，包括磨損顆粒刺激的巨噬細(xì)胞，RANKL-RANK鏈可以

3、啟動(dòng)破骨細(xì)胞形成和成熟破骨細(xì)胞功能的活化。RANK是調(diào)節(jié)炎癥性破骨細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，顆粒刺激細(xì)胞后激活RANK信號，顆粒刺激下的外周血單核細(xì)胞促進(jìn)RANK轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子的釋放。
　　 假體組件的磨損顆粒在假體松動(dòng)中發(fā)揮重要作用，研究認(rèn)為假體磨損顆粒激發(fā)了不同的生物學(xué)組織反應(yīng)，包括骨假體界面肉芽組織的形成，巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞聚集、骨溶解吸收導(dǎo)致假體松動(dòng)。在這一過程中可以觀察到循環(huán)血單核細(xì)胞在假體

4、部位浸潤，但是其形成假體周圍界膜的過程、與骨溶解的關(guān)系還不明確。
　　 為了研究磨損顆粒相關(guān)的骨溶解機(jī)理，探明破骨細(xì)胞分化以及功能活化的分子學(xué)基礎(chǔ)。人們建立了實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，目前用于研究的?shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶w外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、假體植入動(dòng)物模型等，但是體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷贸龅慕Y(jié)論不能直接用來說明體內(nèi)的過程，動(dòng)物模型中常用狗，羊，馬及兔等大型動(dòng)物但是缺點(diǎn)是研究費(fèi)用高，不易于飼養(yǎng)管理，樣本含量受到限制，特別不適合新型治療策略的研究，從而限制了這些動(dòng)物模型

5、的廣泛使用。小鼠與人類具有基因同源性，利于進(jìn)行生物學(xué)研究等優(yōu)點(diǎn)，成為研究假體松動(dòng)模型的新的選擇。Dr.Wooley實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)小鼠的氣囊模型用來研究不同顆粒的細(xì)胞反應(yīng)和骨溶解效果，為了更接近體內(nèi)假體磨損額粒環(huán)境，需要設(shè)計(jì)一理想的模型。我們設(shè)計(jì)該實(shí)驗(yàn)將建立模型并應(yīng)用動(dòng)物模型研究外周血單核細(xì)胞參與骨溶解的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　 目的：
　　 建立重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠-人假體組織嵌合體模型，同時(shí)研究免疫抑制劑ASGMl阻斷宿主免

6、疫對人PBMC浸潤的影響。
　　 利用這一改進(jìn)的動(dòng)物模型研究外周血單核細(xì)胞在假體周圍組織形成中的作用，以及對促炎癥細(xì)胞因子分泌的影響。
　　 同時(shí)研究聚甲基丙烯酸甲脂顆粒、鈦鋁釩合金顆粒刺激PBMC后對細(xì)胞因子和單核細(xì)胞系標(biāo)志物表達(dá)的，以及對破骨細(xì)胞分化和功能活化的影響，以探討骨溶解的分子學(xué)機(jī)制。為臨床選擇假體和防治骨溶解相關(guān)的假體松動(dòng)提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分，第一部分：建立SC

7、ID-Hu人-小鼠嵌合體模型，研究PBMC的浸潤規(guī)律及其對骨溶解的影響，以及ASGMl阻斷宿主免疫對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛦魏思?xì)胞分布的影響。第二部分通過SCID-Hu嵌合體模型，研究PMMA及Ti顆粒刺激對PBMC遷徙的影響和對IL-1， IL-6，TNF， RANK等細(xì)胞因子表達(dá)的影響。
　　 1.動(dòng)物與分組第一部分：32只4周齡雌性重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠隨機(jī)分為三組，Ⅰ組為對照組，植入人假體周圍軟組織和骨片，不注射PBMC細(xì)胞。Ⅱ組為注射

8、PBMC組，植入人假體周圍軟組織和骨片，并注射PBMC細(xì)胞。Ⅲ組為注射PBMC合并ASGM-1處理組，植入人假體周圍軟組織和骨片，注射PBMC細(xì)胞和ASGM-1。
　　 第二部分：36只4周齡雌性重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠隨機(jī)分為三組，每組12只，Ⅰ組為對照組，注射未經(jīng)顆粒刺激的PBMC；Ⅱ組為PMMA組，注射PMMA顆粒刺激的PBMC；Ⅲ組為Ti組，注射Ti顆粒刺激的PBMC；
　　 2.PBMC標(biāo)記與移植接受假體返修的病人

9、抽取25 ml外周血通過梯度離心的方法提取外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞濃度達(dá)到5×106/ml。然后用PKH2綠色熒光染料標(biāo)記PBMC，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活力并采集圖像，標(biāo)記后的PBMC在RPMI1640+10％胎牛血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，3天后兩實(shí)驗(yàn)組每只小鼠腹腔內(nèi)注射5×106細(xì)胞。
　　 3.SCID-Hu模型的建立假體翻修時(shí)切取病人假體周圍界膜軟組織和松質(zhì)骨作為植入標(biāo)本，假體周圍軟組織切成2 mm3組織塊，松質(zhì)骨剪成1×1×2mm

10、3組織塊，植入左側(cè)股四頭肌、椎旁肌。SCID小鼠氯胺酮聯(lián)合甲苯噻嗪腹腔注射麻醉，平均用量0.2ml-0.3ml。同時(shí)將其余組織塊冷凍并放入-80℃低溫冰箱內(nèi)作為植入前的對照。
　　 4.ASGM1處理根據(jù)分組情況Ⅲ組SCID小鼠腹腔內(nèi)PKH2標(biāo)記的PBMC，以及ASGM1，術(shù)后7天Ⅲ組SCID小鼠腹腔內(nèi)補(bǔ)充注射ASGM1200μl。Ⅱ組單獨(dú)注射PBMC，不用ASGM1，Ⅰ組為PBS對照組。第二部分實(shí)驗(yàn)無此步驟。
　　 5

11、組織學(xué)及免疫組織化學(xué)分析OCT包埋組織塊后切取6μm厚度冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察植入組織，以及宿主脾臟、肝臟、肺臟、腎臟內(nèi)有無熒光細(xì)胞。經(jīng)過脫鈣處理的組織行HE染色觀察PBMC的分布并作細(xì)胞計(jì)數(shù)。免疫組織化學(xué)染色評價(jià)外周血單核細(xì)胞標(biāo)志物CD68、致炎因子和破骨細(xì)胞生成調(diào)節(jié)因子RANKL的水平，抗小鼠CD68抗體檢查宿主細(xì)胞情況，Image-Pro Plus系統(tǒng)采集免疫組織化學(xué)圖片并計(jì)算積分光密度值。
　　 6.RT-PCR檢

12、查基因表達(dá)細(xì)胞因子IL-1， IL-6，TNF， RANK，CPK和CTR通過RT-PCR方法測定其表達(dá)。
　　 7.ELISA檢查ELISA方法測定IL-1、IL-6、TNF水平。
　　 8.MicroCT測定BMD術(shù)后當(dāng)日及術(shù)后14天小鼠行MicroCT檢測并計(jì)算骨密度的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.異種移植物被SCID小鼠接受SCID小鼠均耐受手術(shù)操作，植入的人假體周圍組織成活良好，無感染和組織排

13、異反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)過程中小鼠無死亡，HE染色顯示植入組織內(nèi)磨損顆粒廣泛分布，周圍有大量細(xì)胞浸潤。
　　 2.PKH2標(biāo)記PBMC結(jié)果體外PKH2標(biāo)記PBMC后觀察，所有PBMC在熒光顯微鏡下均出現(xiàn)典型的綠色熒光表現(xiàn)，熒光標(biāo)記可以持續(xù)6周。
　　 3.PBMC在SCID-Hu嵌合體的分布兩周后取材做冰凍切片觀察植入假體周圍組織和宿主內(nèi)臟組織熒光PBMC細(xì)胞，植入的人假體周圍組織可見大量PBMC細(xì)胞浸潤，小鼠脾臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)少量散在的熒

14、光細(xì)胞，小鼠腎臟、肝臟、肺組織內(nèi)無熒光細(xì)胞發(fā)現(xiàn)。注射PBMC組假體周圍組織細(xì)胞數(shù)量明顯多于未注射組，假體周圍組織中細(xì)胞浸潤計(jì)數(shù)，與單純PBMC處理組比較，ASGM1+PBMC處理組PBMC數(shù)量減少。與非顆粒刺激對照組比較PMMA顆粒組細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。
　　 4.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果假體周圍組織中細(xì)胞浸潤計(jì)數(shù)表明，ASGM1處理組比單純PBMC處理組減少。異種移植物所有分組抗人CD68陽性細(xì)胞分布廣，宿主起源的巨噬細(xì)胞亦浸潤假體周圍

15、組織。IOD值兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組CD68，RANKL，TNF與對照組比較差異顯著。
　　 PMMA組和Ti組IL-1染色I(xiàn)OD值明顯高于非顆粒刺激對照組，同時(shí)Ti組TNF因子亦高于對照組。
　　 5.RT-PCR結(jié)果假體周圍組織致炎性細(xì)胞因子及破骨細(xì)胞標(biāo)志物的基因表達(dá)結(jié)果顯示：與對照組比較，PBMC注射組明顯高表達(dá)IL-1，TNF， RANK。第二部分結(jié)果顯示，與無顆粒刺激對照組比較，PMMA顆粒刺激組mRNA明顯高表達(dá)IL-1

16、，TNF，RANK，Ti顆粒刺激組基因表達(dá)差異不顯著。
　　 6.ELISA結(jié)果ELISA測定樣品中致炎細(xì)胞因子的濃度，第一部分結(jié)果：與對照組比較PBMC+PBS組IL1、IL6、TNF濃度明顯提高，PBMC+ASGM1組IL6濃度明顯提高。第二部分結(jié)果：與對照組比較，致炎因子IL1、IL6、TNF在PMMA組和Ti組均明顯升高。
　　 7.MicroCT結(jié)果假體周圍組織植入SCID小鼠后，MicroCT掃描分析，第一部

17、分結(jié)果表明，三組均有不同程度的骨密度降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PBMC組和PBMC+ASGM1組與對照組比較均有顯著性差異。第二部分結(jié)果表明與PBS對照組比較，PMMA組骨密度值明顯下降，差異有顯著性，Ti組和PBS對照組比較，有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 (1)SCID小鼠對人假體組織有良好的相容性，SCID-Hu模型是研究顆粒相關(guān)的骨溶解的良好動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 (2)人外周血單核細(xì)胞在假體周圍組織形成過程中

18、發(fā)揮重要作用，PBMC可以特異性浸潤到假體周圍組織并對局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮作用。宿主非特異性免疫細(xì)胞亦參與移植物周圍細(xì)胞組成，建立SCID-Hu動(dòng)物模型時(shí)，利用ASGM1阻斷宿主的細(xì)胞免疫是必要的。
　　 (3)PMMA、Ti顆粒刺激可以使RANK、IL1、IL6、TNF等致炎細(xì)胞因子高表達(dá)，促進(jìn)PBMC向假體組織轉(zhuǎn)移，激活破骨細(xì)胞，而且不同顆粒的生物反應(yīng)強(qiáng)度不同。
　　 (4)此實(shí)驗(yàn)將人假體周圍組織和單核細(xì)胞同時(shí)植入重度聯(lián)