不同來源動物全血或單核細胞以及人源單核細胞系體外熱原檢測的方法學研究.pdf

1、目的：本課題以人體發(fā)熱機理為試驗原理，研究二類體外模型：①動物全血及單核細胞，②人源單核細胞系，考察它們用于檢測熱原的可行性，以期建立新的體外熱原檢測體系，并對其進行應用研究。
　　方法：(1)采用大鼠全血，以細胞因子（TNF-α）為檢測指標；采用大鼠外周血單核細胞，以細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）為檢測指標；(2)采用豬全血，以細胞因子（IL-1β、IL-6）為檢測指標；(3)采用家兔外周血單核細胞，以細胞因子（I

2、L-1β、IL-6、TNF-α）為檢測指標；(4)采用人源單核細胞系 THP1，以 TNF-α（THP1細胞液 V:熱原樣品 V=4:1及1:1）和Neo（THP1細胞液 V:熱原樣品 V=4:1）為檢測指標；(5)采用人源單核細胞系28SC，以細胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）為檢測指標，考察無活化物存在以及活化物 calcitriol濃度為10、100ng/ml時活化28SC后對各類熱原的反應活性，確定檢測指標以及活化物

3、calcitriol的濃度，建立28SC熱原檢測體系，及研究不同傳代次數(shù)（15、45代）對28SC穩(wěn)定性的影響；(6)采用本實驗室構(gòu)建的熱原復合物和內(nèi)毒素法檢查不合格的樣品 b型流感疫苗，對人源單核細胞系28SC進行應用性研究。
　　對上述試驗進行熱原檢測的可行性研究。
　　結(jié)果：(1)大鼠全血-TNF-α-法，大鼠外周血單核細胞-IL-1β、IL-6法對LPS不能檢測到0.5EU/ml（前期結(jié)果表明，LPS引起家兔體溫升高

4、0.6℃的最小濃度為0.5EU/ml），不適用于檢測熱原；大鼠外周血單核細胞-TNF-α法，對LPS可檢測到0.25EU/ml，適用于檢測熱原；(2)豬全血-IL-1β法對LPS的最低檢測限為0.125EU/ml，線性范圍為0.0125~0.5EU/ml，R=0.9754；豬全血-IL-6法對LPS的最低檢測限為0.0625EU/ml，線性范圍為0.0625~0.5EU/ml，R=0.9959，豬全血-IL-1β、IL-6法適用于檢測熱

5、原；(3)兔外周血單核細胞-IL-1β、IL-6、TNF-α法對LPS不能檢測到0.5EU/ml，不適用于檢測熱原；(4) THP1-TNF-α法的兩種孵育體系對LPS均不能檢測到0.5EU/ml；THP1-Neo法對LPS不能檢測到0.5EU/ml，兩種指標均不適用于檢測熱原；(5)無活化物存在時，28SC-IL-1β、IL-6、TNF-α法對LPS不能檢測到0.5EU/ml；活化物 calcitriol濃度為10ng/ml時，28S

6、C- IL-1β、TNF-α法對LPS不能檢測到0.5EU/ml，28SC-IL-6法對LPS可檢測到0.25EU/ml，對LTA不能檢測到0.5μg/ml(前期結(jié)果表明，LTA引起家兔體溫升高0.6℃的最小濃度為0.5μg/ml），對Zymosan不能檢測到16.0μg/ml(前期結(jié)果表明，Zymosan引起家兔體溫升高0.6℃的最小濃度為16.0μg/ml）；活化物 calcitriol濃度為100ng/ml時，28SC-IL-1β

7、、TNF-α法對LPS可檢測到0.5EU/ml，對LTA不能檢測到0.5μg/ml，對Zymosan不能檢測到16.0μg/ml，28SC-IL-6法對LPS可檢測到0.25EU/ml，最低檢測限可達到0.031EU/ml，線性范圍為0.031~0.5EU/ml，R=0.9432，對LTA可檢測到0.5μg/ml，對Zymosan可檢測到16.0μg/ml，該體系適用于檢測熱原；確定28SC熱原檢測體系的活化物 calcitriol濃度

8、為100ng/ml，檢測指標為細胞因子 IL-6；經(jīng) LPS刺激后，45代28SC各劑量組與15代相應劑量組 IL-6含量之間無顯著性差異，對LPS的最低檢測限均可達到0.031EU/ml，線性范圍均為0.031~0.5EU/ml，R15=0.9975，R45=0.9961；(6)對于熱原復合物，28SC熱原檢測體系對其最低可檢測到其16倍稀釋液，而同稀釋倍數(shù)樣品不能引起家兔法體溫升高，檢測方法靈敏度前者高于后者，對于 b型流感疫苗，2

9、8SC熱原檢測體系與細菌內(nèi)毒素法判定結(jié)果一致。
　　結(jié)論：(1)動物全血及單核細胞類模型：大鼠外周血單核細胞-TNF-α法、豬全血-IL-1β、IL-6法適用于檢測熱原，但其適用性尚需進一步研究；(2)人源單核細胞系類模型：體外28SC-IL-6熱原檢測體系，適用于檢測熱原，對LPS的最低檢測限為0.031EU/ml，對LTA可檢測到0.5μg/ml，對Zymosan可檢測到16.0μg/ml；該體系穩(wěn)定性好，在45代時尚有較好的