異丙酚對大鼠內(nèi)毒素血癥外周血單核細胞蛋白質(zhì)表達的影響.pdf

1、靜脈全麻藥異丙酚(propofol)被廣泛應用于臨床麻醉和ICU鎮(zhèn)靜。近年來,異丙酚抑制炎癥反應的功能,越來越受到人們的重視,這方面的研究和報道也日趨增多。但有關(guān)異丙酚抗炎的具體信號轉(zhuǎn)導機制,并不清楚,無法形成完整的理論,從而局限和阻礙了異丙酚抗炎的具體臨床應用。
　　 在建立大鼠內(nèi)毒素血癥的基礎(chǔ)上,提取外周血單核細胞,并進行裂解,雙向電泳,質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì),并得到表達有差異的蛋白。我們選擇與炎癥密切相關(guān)的蛋白質(zhì)膜聯(lián)蛋白A1(An

2、nexin A1),通過重建模型,我們通過western blot方法對膜聯(lián)蛋白A1進行進一步的驗證,結(jié)果顯示與雙向電泳結(jié)果一致,進一步驗證了膜聯(lián)蛋白A1在異丙酚抗炎過程中起了重要的作用。同時我們對血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α并進行檢測,發(fā)現(xiàn)Annexin A1可以顯著的抑制三者的表達,差異具有統(tǒng)計學意義。膜聯(lián)蛋白A1在異丙酚抗炎信號轉(zhuǎn)導機制中起了重要的作用,有研究表明:AnnexinA1強烈抑制細胞IL-6的的表達,

3、此種效應則是通過P38MAPK激活影響mRNAd穩(wěn)定。P38MAPK是絲氨酸/蘇氨酸相互轉(zhuǎn)化的重要一個過程,是一種促進細胞分裂的蛋白激酶。P38通路的激活在前炎性因子(比如IL-1β,TNF-α和IL-6)的產(chǎn)生中起了重要作用,對某些酶的誘導作用,比如環(huán)氧化酶2(COX-2),COX-2可以控制病理條件下結(jié)締組織的塑形；作為一種氧化作用的調(diào)節(jié)因子,可以調(diào)節(jié)iNO的表達；誘導血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)、其他的粘附蛋白以及其他的炎

4、性相關(guān)的分子。
　　 材料和方法:
　　 1.驗動物準備與分組:
　　 18只雄性SD大鼠,體重180～220 g,均禁食過夜,用烏拉坦(1.0g/kg)肌肉注射麻醉后,行右側(cè)股靜脈插管建立靜脈輸液通道。
　　 將18只SD大鼠隨機分為內(nèi)毒素組(L組)、內(nèi)毒素+異丙酚組(L+P組)和對照組(C組),每組6只.
　　 2.動物模型制作及藥物輸注:
　　 L組:通過股靜脈注入內(nèi)毒素10 mg/

5、kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注10％脂肪乳,持續(xù)輸注6h.
　　 C組:通過股靜脈注入與內(nèi)毒素等容量生理鹽水后,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注10％脂肪乳,持續(xù)輸注6h.
　　 L+P組:通過股靜脈注入內(nèi)毒素10mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注異丙酚,持續(xù)輸注6h.
　　 3.標本采集:
　　 輸注藥物6h后,分離大鼠右側(cè)頸動脈,取血3～5m

6、l,肝素鈉抗凝管抗凝
　　 4.標本處理:
　　 (1)將3ml抗凝過的大鼠血加入到盛有3ml單核細胞分離液的分離管中.
　　 (2)室溫下400g離心30min,血液分層,吸取白膜層(單核細胞層),加入到另一干凈離心管中,加入10mlDPBS,輕輕吹打混勻,250g離心10min
　　 (3)將離心管中上層液體棄之,加入5mlDPBS,吹打混勻,250g離心10min
　　 (4)重復步驟上一步

7、
　　 (5)按照細胞體積4倍加入裂解液,4℃冰箱靜置30min,
　　 (6)4℃離心機、12000rpm,離心15min,取上清液,-80℃凍存.
　　 5..雙向電泳
　　 5.1定量
　　 將各組內(nèi)的裂解細胞混合在一起,采用bradford法進行蛋白定量,參照試劑盒的說明進行操作。各組蛋白質(zhì)濃度在10-15ug/ul,各組間的濃度較接近.
　　 5.2第一向等電聚集
　　

8、采用Amersham IPGghor公司的第一向等電聚焦系統(tǒng)及Ettan Daltsix垂直電泳系統(tǒng),參照儀器說明書進行操作。采用24cm,ph值3-10的膠條,上樣量為150ug;泡漲盤泡漲12小時.轉(zhuǎn)入第一向等電聚焦系統(tǒng),電泳條件設(shè)置是:S1(200v,1hr,200vhs,step),S2(500v,1hr,500vhs,step),S3(1000v,1hr,1000vhs,step),S4(5000v,1hr,5000vhs,s

9、tep),S5(8000v,0.5hr,4000vhs,Grad),S6(8000v,6.5hr,60000vhs,step),S7(500v,5hr,500vhs,step)
　　 5.3平衡:兩步平衡法進行平衡,各15min
　　 5.4 SDS-PAGE電泳
　　 電泳條件設(shè)置為:s1(5w pergel,45min),s2(20w per gel,6h,當溴酚藍遷移到膠的底部即可結(jié)束電泳)；
　　

10、 5.5染色
　　 雙向結(jié)束后,采用Amersham公司Coomassie Brilliant Blue R250染料,按建議的流程進行染色。
　　 6、掃描分析
　　 考染后的雙向電泳凝膠,采用Umax PowerLook 1100投射掃描儀進行掃描,以TIF格式保存圖像。采用Bio-Rad二維圖譜分析軟件PDQuest 8.0進行圖像分析,包括背景削減,去除條紋、斑點檢測,匹配等分析。軟件自動匹配與人工匹配相

11、結(jié)合,設(shè)定表達量相差2倍以上為差異表達范圍,軟件自動進行分析,給出差異表達蛋白質(zhì)點的數(shù)據(jù)信息。
　　 7、質(zhì)譜鑒定、蛋白質(zhì)檢測和數(shù)據(jù)分析
　　 通過4800 MALDI TOF/TOF Analyzer(Applied Biosystems,USA)進行蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)譜鑒定。用肽質(zhì)量指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprint,PMF)和肽序列標簽通過MASCOT搜索引擎(http://www.matrix

12、science.com/,確MatrixSicence Ltd.,London,UK)并對照SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫對蛋白質(zhì)進行檢測和數(shù)據(jù)分析。肽段的質(zhì)量誤差在0.01-0.1％范圍內(nèi)。匹配肽段超過4個,MASCOT得分大于64分的蛋白認為有統(tǒng)計學意義
　　 8、膜聯(lián)蛋白A1的驗證
　　 8.1動物分組和藥物輸注
　　 將新的24只雄性SD大鼠,體重180～220 g,隨機分為四組
　　 內(nèi)毒素組(

13、L組)
　　 對照組(C組)
　　 內(nèi)毒素組+異丙酚(L+P組)
　　 異丙酚組(P組)
　　 模型制作及藥物輸注
　　 L組:通過股靜脈注入內(nèi)毒素10 mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注10％脂肪乳,持續(xù)輸注6h
　　 C組:通過股靜脈注入與內(nèi)毒素等容量生理鹽水后,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注10％脂肪乳,持續(xù)輸注6h
　　 L+P組:通

14、過股靜脈注入內(nèi)毒素10mg/kg,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注異丙酚,持續(xù)輸注6h
　　 P組:通過股靜脈注入與內(nèi)毒素等容量生理鹽水后,然后以10 mg.kg-1h-1的速度持續(xù)輸注異丙酚,持續(xù)輸注6h
　　 8.2樣品采集及細胞蛋白裂解
　　 輸注6h為采血點,每只大鼠取血約6ml,其中3ml用于分離單核細胞,3ml用于分離血清,將分離的單核細胞裂解,裂解后的蛋白-80℃凍存。
　　

15、8.3western blot檢測
　　 對質(zhì)譜分析得到的差異蛋白點進行Western blot驗證。從各組提取500μg總蛋白后用12％SDS-PAGE膠分離,并轉(zhuǎn)至PVDF膜。隨后,用含5％脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1h。封閉結(jié)束后,在搖床上與一抗anti-AnnexinA1 rabbit polyclonal antibody(1:1000；Abcam)4℃孵育過夜。孵育結(jié)束后,已經(jīng)結(jié)合一抗的PVDF膜用TBST

16、溶液漂洗3次,接著與辣根過氧化酶偶聯(lián)的二抗horseradish peroxides-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G(1:2000；CellSignaling Technology,Danvers MA)溶液孵育1 h,實驗采用增強化學發(fā)光法。Western blot結(jié)束后的圖像由Image station 2000R系統(tǒng)(美國Kodak公司)成像,并用生產(chǎn)商提供的軟件進行分析。
　

17、　 8.4 ELISA法檢測
　　 Annexin A1表達的增高能夠抑制血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的釋放的釋放,我們采用ELISA試劑盒檢測了各組大鼠血清中上述炎癥因子的含量,
　　 8.5磷酸化P38MAPK的檢測
　　 使用抗磷酸化P38MAPK(Thr180/Tyr182)(3D7)兔多克隆抗體(1:1000；Cell Signaling Technology)和辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗

18、兔免疫球蛋白G(1:2000；CellSignaling Technology,Danvers MA)檢測P38MAPK。
　　 9、數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包,計量資料以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,組間IL-1β、IL-6、TNF-α以及Westernblot膠的灰度值的比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義
　　 結(jié)論:
　　 1、利用蛋白質(zhì)組學的方法,首次發(fā)