內(nèi)毒素血癥大鼠心肌細(xì)胞骨架蛋白基因表達(dá)的變化.pdf

1、由革蘭氏陰性菌感染時(shí)，細(xì)菌胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)大量釋放入血可造成內(nèi)毒素血癥，常引起機(jī)體廣泛的失控性炎癥和免疫反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)休克、全身炎癥反應(yīng)綜合癥、混合性免疫拮抗綜合癥、多器官功能衰竭等廣泛的損害和影響。對體內(nèi)重要的器官-心臟來說，LPS還可導(dǎo)致心肌收縮力減弱、心率減慢，嚴(yán)重影響心臟功能。但LPS是否對心肌組織有直接的損害以及這種損害的作用機(jī)制如何，目前并不清楚。由于心肌病的研究提示心肌細(xì)胞

2、骨架蛋白變化對心功能有較大影響，我們推測LPS可能對心肌細(xì)胞骨架成分也會(huì)產(chǎn)生干擾和損害作用。 本室前期的研究工作表明，LPS可引起心肌細(xì)胞內(nèi)纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-Actin)、結(jié)蛋白(desmin)等骨架蛋白的形狀分布和含量發(fā)生變化。LPS可使心肌細(xì)胞皮質(zhì)部分F-Actin染色密度降低，細(xì)胞內(nèi)排列異常，形成應(yīng)力纖維：LPS刺激幼鼠心肌細(xì)胞8小時(shí)，可見心肌細(xì)胞內(nèi)desmin免疫熒光染色強(qiáng)度顯著降低，desmin分布變得不規(guī)則。上述骨

3、架蛋白含量減少、發(fā)生變形及應(yīng)力纖維的形成可能是LPS導(dǎo)致心肌舒縮功能降低的重要原因之一。 心肌細(xì)胞骨架蛋白的含量及分布變化可能與基因轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)水平的改變、骨架蛋白的解聚與失活等因素有關(guān)。由于前期免疫熒光染色檢測顯示細(xì)胞骨架蛋白在蛋白質(zhì)表達(dá)水平有變化，因此本研究擬運(yùn)用RT-PCR等方法深入一步觀察心肌細(xì)胞骨架蛋白在基因轉(zhuǎn)錄水平是否也有變化，為深入探討心肌細(xì)胞骨架蛋白變化的機(jī)制提供有益的參考。 本研究采用LPS刺激心肌組

4、織和細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測心肌細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)和結(jié)蛋白(Desmin)的轉(zhuǎn)錄活性變化；觀察心肌細(xì)胞損傷指標(biāo)-血漿肌酸激酶(CK)的活性變化，連續(xù)監(jiān)測左心室舒張功能的指標(biāo)[左心室舒張末壓(leftyentricularenddiastolicpressure，LVEDP)和左心室內(nèi)壓最大下降速率-dp／dtmax]和反映左心室收縮功能的指標(biāo)[左心室收縮壓(leftventriculars

5、ystolicpressure，LVSP)和左心室內(nèi)壓最大上升速率+dp／dtmax]的改變情況，以探討LPS作用于心肌后影響心肌細(xì)胞收縮和舒張功能的可能途徑和機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)中采用沙門氏菌屬的精制內(nèi)毒素注入Wistar大鼠體內(nèi)(10mg／kg體重)復(fù)制內(nèi)毒素血癥模型，觀察以及檢測大鼠的心功能變化，結(jié)果顯示，注射內(nèi)毒素后4-8小時(shí)，部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)心跳呼吸加快、鼻腔噴出白色淡黃色、粉紅色泡沫痰等典型的急性左心衰竭表現(xiàn)。心功能指標(biāo)方面

6、，HR、LVSP、+dp／dtmax、-dp／dtmax均顯著下降，而LVEDP下降并不明顯。與對照組相比HR、LVSP、+dp／dtmax、-dp／dtmax指標(biāo)存在顯著性差異，而LVEDP指標(biāo)差異不顯著。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，LPS對心功能的負(fù)性作用很可能以降低心肌收縮能力為主。 LPS不僅引起心肌功能學(xué)方面的變化，而且可使心肌細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。大鼠一次性給與注射LPS(10mg／kg體重)處理，8小時(shí)后光學(xué)顯微鏡下可見

7、LPS心肌組織出現(xiàn)滲血現(xiàn)象，心肌細(xì)胞橫紋不清晰，胞漿內(nèi)可見中毒顆粒。48小時(shí)后存活大鼠的上述病理改變?nèi)晕椿謴?fù)正常。 內(nèi)毒素處理4h組、8h組、24小時(shí)組的大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)電子顯微鏡檢查可發(fā)現(xiàn)隨著內(nèi)毒素作用時(shí)間的延長，纖維方向及橫紋逐漸模糊消失、線粒體嵴也逐漸減少，細(xì)胞間質(zhì)(間質(zhì)細(xì)胞、血管等)受損加重，細(xì)胞間隙明顯變大，但纖維溶解現(xiàn)象并不明顯。 以GAPDH為內(nèi)參照的情況下進(jìn)行了三種骨架蛋白的基因表達(dá)水平檢測。用RT-PC

8、R方法逆轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增了肌動(dòng)蛋白(Actin)、微管蛋白(Tubulin)、結(jié)蛋白(Desmin)mRNA，水平瓊脂糖電泳、EB熒光染色及凝膠光密度圖像分析進(jìn)行半定量檢測。結(jié)果顯示，注射內(nèi)毒素后32小時(shí)內(nèi)各組Actin轉(zhuǎn)錄水平與0小時(shí)組比較沒有顯示出顯著性差異；40小時(shí)之后轉(zhuǎn)錄水平顯著上升(2.231±0.545，與0小時(shí)組比較P=0.000)，之后維持在較高水平，直至72小時(shí)仍顯著高于0小時(shí)組；注射內(nèi)毒素后Tubulin轉(zhuǎn)錄水平16小時(shí)以

9、內(nèi)的變化無顯著差異，24小時(shí)則較前顯著降低(0.749±0.090，與0小時(shí)組比較P=0.027)，32小時(shí)仍維持低水平(0.759±0.067，與0小時(shí)組比較P=0.031)，然后回升維持在接近注射前的水平，72小時(shí)內(nèi)未見表達(dá)的高峰。而Desmin基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯改變。值得注意的是，這幾種細(xì)胞骨架蛋白的變化趨勢與組織的總RNA含量變化趨勢并不一致?？赡苁窃诖藨?yīng)激狀態(tài)下組織細(xì)胞動(dòng)員較多的調(diào)控機(jī)制以增加某些功能蛋白如一些熱休克蛋白的表

10、達(dá)，而對屬于結(jié)構(gòu)蛋白的細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)暫時(shí)退居次要地位。 本實(shí)驗(yàn)中未檢測到內(nèi)毒素對大鼠血漿肌酸激酶活性的影響，數(shù)據(jù)顯示各時(shí)間點(diǎn)血漿CK值無顯著性差異?？赡芘c樣本量較小、數(shù)據(jù)的離散性較大有關(guān)。 根據(jù)以上研究我們可以得出以下初步結(jié)論：(1)在整體水平上，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)LPS對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心功能有明確的損害，而且此損害以降低收縮功能為主，對舒張功能的影響可能沒有收縮功能那么顯著。(2)在組織水平上，LPS長時(shí)間(8小時(shí))刺激后可使