硫酸吲哚酚對單核細胞趨化功能的影響及機制研究.pdf

1、成人慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)發(fā)病率逐年上升，多數(shù)國家超過10％，現(xiàn)已成為嚴重影響人類健康的全球公共衛(wèi)生問題。隨著CKD病情進展，部分患者將進入終末期腎病(End-stage renal disease，ESRD)，體內(nèi)大量尿毒癥毒素蓄積，只能靠血液凈化或腎移植維持生命。ESRD患者體內(nèi)尿毒癥毒素蓄積，是導致尿毒癥狀況的根本原因。歐洲尿毒素研究組(European uremic toxin wor

2、k group，EUTox)根據(jù)這些毒素的分子量大小及蛋白結(jié)合特性將其分為小分子水溶性物質(zhì)(Free water-solublelow-molecular-weight solutes)(＜500Da)、蛋白結(jié)合毒素(Protein-bound uremictoxins，PBUTs)和中分子物質(zhì)(Middle molecules)(＞500Da)三類。隨著透析技術(shù)的不斷改進，分子量小于20kDa的化合物，即大部分的小分子水溶性毒素和中分

3、子毒素可被有效清除。然而，以硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate，IS)為代表的PBUTs，因常與血漿中的蛋白質(zhì)，尤其是與白蛋白(Human serum albumin，HSA)緊密結(jié)合而具有大分子物質(zhì)的特性，現(xiàn)有的透析手段難以將其清除。
　　心、腦血管事件是CKD患者的常見并發(fā)癥，即便是進入了維持性血液透析治療其發(fā)病率仍居高不下，成為導致透析患者死亡的主要原因?，F(xiàn)有的透析技術(shù)不能清除PBUTs，提示PBUTs可能與CKD患

4、者心、腦血管事件的高發(fā)生率有著密切聯(lián)系。既往研究發(fā)現(xiàn)，PBUTs的典型代表IS可損傷血管內(nèi)皮細胞、促進血管平滑肌細胞增殖等，使受損的血管發(fā)生炎癥反應，釋放單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)等炎癥細胞因子，MCP-1可與單核/巨噬細胞表面的CC類趨化因子受體-2(C-C chemokine receptors2，CCR2)特異性結(jié)合，進而激活并誘導外周血中單核/巨噬細胞向炎癥部位

5、遷移、黏附、浸潤，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生。可見單核/巨噬細胞在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中起著重要作用，而這一過程需要MCP-1等炎癥細胞因子及其受體的參與。既往關(guān)于PBUTs致動脈硬化的相關(guān)研究中，多集中于PBUTs損傷血管產(chǎn)生炎癥反應，進而激活、誘導外周血中的單核/巨噬細胞向炎癥部位黏附和浸潤。但PBUTs可否直接作用于單核/巨噬細胞，能否通過增強單核/巨噬細胞的趨化、遷移功能而加速動脈粥樣硬化等炎癥相關(guān)并發(fā)癥的進展，目前尚缺乏相關(guān)報道

6、，有待于進一步研究。
　　目的：
　　本研究以THP-1人單核細胞作為研究對象，通過體外實驗觀察蛋白結(jié)合IS和游離IS對THP-1細胞趨化功能的影響及其可能機制，從而探討IS與CKD患者動脈粥樣硬化及其他炎癥相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系。
　　方法：
　　1.體外配制不同濃度的蛋白結(jié)合IS溶液(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L,4％HSA+IS400μmol/L,4％HSA+IS800μ

7、mol/L)，用30K的Amicon Ultra-15離心過濾器超濾離心，以高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)檢測超濾液中游離IS的含量，分別計算出IS的游離率和蛋白結(jié)合率。
　　2.體外培養(yǎng)THP-1細胞，分別以不同濃度的蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L,4％HSA+IS400μmol/L,4％HSA+IS8

8、00μmol/L)和游離IS(IS100，200，400，800μmol/L)處理12、24、48h后，以CCK-8法對各組單核細胞進行增殖活性檢測。
　　3.按實驗分組:空白對照組（PBS平衡溶液），陰性對照組（4％HSA溶液），蛋白結(jié)合IS組(4％HSA+IS200μmol/L)，游離IS組(IS200μmol/L)處理THP-1細胞，進行Transwell實驗，檢測蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)和游離IS

9、(IS200μmol/L)對THP-1細胞趨化功能的影響。
　　4.將體外培養(yǎng)的THP-1細胞分別以蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)和游離IS(IS200μmol/L)處理24h，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunoabsorbentassay，ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中MCP-1的濃度。
　　5.將體外培養(yǎng)的THP-1細胞分別以蛋白結(jié)合IS(4％HSA+IS200μmol/L)

10、和游離IS(IS200μmol/L)處理24h，流式細胞術(shù)檢測THP-1細胞表面CCR2的表達。
　　結(jié)果：
　　1.自制的不同濃度的蛋白結(jié)合IS溶液(4％HSA+IS100μmol/L，4％HSA+IS200μmol/L，4％HSA+IS400μmol/L，4％HSA+IS800μmol/L)中IS的游離率分別為:11.5％，12.8％，9.2％和7.85％，蛋白結(jié)合率分別為88.5％，87.2％，90.8％和92.15％

11、。
　　2.IS對單核細胞增殖抑制作用的影響:①游離IS對THP-1細胞的增殖具有抑制作用，隨著游離IS的作用濃度增加，其對THP-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強，具有濃度依賴性（P＜0.05）;隨著游離IS作用時間的延長，其對THP-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強，具有時間依賴性(P＜0.05)。②蛋白結(jié)合IS對THP-1細胞的增殖也具有抑制作用，隨著蛋白結(jié)合IS作用濃度的增加，其對THP-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強，大于200μ

12、mol/L的三個濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義;同時，隨著蛋白結(jié)合IS作用時間的延長，其對THP-1細胞的增殖抑制作用逐漸增強，但作用24h后各時間點間無統(tǒng)計學差異。
　　3.按實驗分組處理THP-1細胞24h后，趨化實驗結(jié)果顯示:空白對照組(PBS平衡溶液)平均穿膜細胞數(shù)為(13.2±5.6)個/視野;陰性對照組（4％HSA溶液）平均穿膜細胞數(shù)為(14.5±6.4)個/視野;蛋白結(jié)合IS組（4％HSA+IS200μmol/L

13、溶液）平均穿膜細胞數(shù)為(85.2±26.8)個/視野;游離IS組（IS200μmol/L溶液）平均穿膜細胞數(shù)為(123.5±48.6)個/視野。與兩對照組相比，蛋白結(jié)合IS組和游離IS組趨化細胞數(shù)明顯增多，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）;兩實驗組間比較，游離IS組穿膜細胞數(shù)較蛋白結(jié)合IS組穿膜細胞數(shù)明顯增多，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.按實驗分組處理THP-1細胞24h，與兩對照組比較，游離IS組(IS200μ

14、mol/L)和蛋白結(jié)合IS組(4％HSA+ IS200μmol/L) MCP-1濃度明顯升高，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);兩實驗組間比較，游離IS組MCP-1濃度高于蛋白結(jié)合IS組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.按實驗分組處理THP-1細胞24h，與兩對照組比較，游離IS組CCR2表達率明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;與陰性對照組比較，蛋白結(jié)合IS組的CCR2表達均增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜

15、0.05);游離IS組與蛋白結(jié)合IS組之間比較，前者CCR2表達率明顯高于后者，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　蛋白結(jié)合IS和游離IS均對單核細胞具有增殖抑制作用，且呈濃度依賴性;蛋白結(jié)合IS同游離IS一樣，可上調(diào)MCP-1和CCR2的表達，進而增強單核細胞的趨化功能;由于循環(huán)中蛋白結(jié)合的IS是游離IS的9倍，所以其對單核細胞趨化功能的影響更應引起高度重視;設法解離與白蛋白結(jié)合的IS，增加IS的透析清除率，