健康成人肝臟線粒體蛋白質(zhì)表達譜的構(gòu)建和mRNA-蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性影響因素的多元回歸分析.pdf

1、線粒體作為細胞的產(chǎn)能中心、代謝中心和凋亡中心，在生命過程中發(fā)揮著重要的生理功能，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。對線粒體的研究由來已久，但對其功能和蛋白質(zhì)構(gòu)成仍未完全清楚。蛋白質(zhì)表達譜構(gòu)建(profiling)作為高通量、規(guī)?；难芯糠椒?，從整體上研究某一生理或病理狀態(tài)下線粒體所有蛋白質(zhì)，為從蛋白質(zhì)水平詮釋線粒體功能及其在疾病中的作用機制提供新的方法。 本研究利用聯(lián)合提取細胞器的方法，提取高純度的肝臟線粒體，并進行形態(tài)學和純度

2、評價。其蛋白質(zhì)表達譜的構(gòu)建，采用SDS-PAGE結(jié)合nano-LC-ESI-MS/MS的技術(shù)策略，并引入質(zhì)譜分段掃描的分離模式(GPF)。經(jīng)反轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)庫評價，確定95％可信度、雙肽段匹配(95P2)的數(shù)據(jù)標準。為了明確所鑒定蛋白質(zhì)的亞細胞定位，我們采用逐步遞進的數(shù)據(jù)判定方法。首先，以期望最大化法(EM)校正的肽段定量為基礎(chǔ)，用最鄰近算法(KNN)來進行分類；其次，在KNN基礎(chǔ)上，用結(jié)合其它六種生物信息學方法(NUCLEO)的貝葉斯模型對所

3、鑒定蛋白質(zhì)進行細胞器定位劃分，其定位預測準確性可達到81％。最終得到線粒體定位的非冗余蛋白質(zhì)774個，其中96個屬于蛋白質(zhì)新定位，291個屬于新定位蛋白質(zhì)。這是目前人肝臟能夠得到明確線粒體定位蛋白質(zhì)的最大數(shù)據(jù)集，將作為一種資源用于人類肝臟的其它研究。對于規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)表達譜數(shù)據(jù)，我們采用GO分類系統(tǒng)及Pfam結(jié)構(gòu)域預測對其進行蛋白質(zhì)功能的發(fā)掘和注釋。根據(jù)GO生物過程的注釋，我們鑒定的蛋白質(zhì)主要參與三大物質(zhì)代謝及能量代謝，綜合其它細胞器鑒

4、定數(shù)據(jù)的GO超幾何分析結(jié)果也與線粒體的功能一致，很好的詮釋了線粒體的功能，表明了肝臟線粒體作為機體代謝中心和“能量工廠”的生理特點。在387個明確定位于線粒體的蛋白質(zhì)中，只有28個與信號傳導相關(guān)，超幾何分析結(jié)果顯示信號傳導功能在肝臟線粒體中明顯缺失(p<0.001)。25個新定位于線粒體的信號類蛋白質(zhì)對我們進一步研究線粒體與其它細胞器間或線粒體內(nèi)的信號傳導有新的提示作用。其中，G蛋白是G蛋白偶聯(lián)信號傳導系統(tǒng)的重要組成部分，以前普遍認為它

5、只定位在細胞膜的內(nèi)表面，最近有其在細胞核膜新定位的報道。8個G蛋白亞基的線粒體定位，提示G蛋白也可能介導跨線粒體膜的信號傳遞，因而可能有助于我們重塑G蛋白偶聯(lián)信號傳導系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)。數(shù)據(jù)標準對表達譜的構(gòu)建至關(guān)重要，95P2及99P1(99％可信度、單肽段以上匹配)是目前國家上認可的數(shù)據(jù)標準。本研究在人肝臟7次重復鑒定的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，計算不同Nobsb1(每個蛋白質(zhì)可觀測到的肽段數(shù))范圍蛋白質(zhì)在95P2數(shù)據(jù)標準下被單次實驗鑒定的可能性，

6、發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)鑒定的均值(8.9％)相比，低Nobsbl蛋白質(zhì)被鑒定的可能性只有0.85％(Nobsbl<35)，相差懸殊。雖然采用95P2數(shù)據(jù)標準可以比99P1多約25％的數(shù)據(jù)量，但是對于低Nobsbl值范圍的蛋白質(zhì)，采用95P2數(shù)據(jù)標準的數(shù)據(jù)量遠遠低于99P1，這與蛋白質(zhì)在質(zhì)譜中的鑒定受其理化性質(zhì)影響有關(guān)。該結(jié)果一方面可以解釋我們數(shù)據(jù)中參與氧化磷酸化蛋白質(zhì)其鑒定率非常低的問題；另一方面也有助于在以后的蛋白質(zhì)組研究中分析低Nobsbl值

7、蛋白質(zhì)的假陰性鑒定問題。根據(jù)中心法則，mRNA(轉(zhuǎn)錄組)和蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組)是基因表達的不同層面，由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的存在，二者在表達豐度上并不完全一致。兩種數(shù)據(jù)的綜合考慮一方面有助于全面了解生物的功能狀態(tài)；另一方面有助于區(qū)分真正的mRNA/蛋白質(zhì)豐度一致或不一致性。對二者相關(guān)性影響因素的分析，有助于我們摒棄數(shù)據(jù)中的噪音干擾，清晰展現(xiàn)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的規(guī)律。關(guān)于mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的研究較多，但結(jié)論頗有爭議。對二者相關(guān)性的影

8、響因素分析多側(cè)重于生物學方面，較少考慮技術(shù)層面的原因，且多為定性描述。本研究提出一個蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)指標：RIPpro(蛋白質(zhì)相對鑒定可能性)，并對其合理性進行了較全面的評估。在此基礎(chǔ)上，對RIPpro等多種影響mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的因素進行了回歸分析。發(fā)現(xiàn)RIPpro變化可以影響蛋白質(zhì)豐度變化的11％、mRNA/蛋白質(zhì)相關(guān)性變化的5％。通過對mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)系數(shù)的分級呈現(xiàn)，總數(shù)據(jù)其二者相關(guān)性是0.59，75％的數(shù)據(jù)其二者

9、相關(guān)性為0.75，有力駁斥了關(guān)于mRNA/蛋白質(zhì)豐度毫無相關(guān)性的說法。對明顯偏離mRNA/蛋白質(zhì)豐度趨勢線的蛋白質(zhì)的功能及理化性質(zhì)進行分析，發(fā)現(xiàn)代謝類蛋白質(zhì)的定量多高于其mRNA預測豐度，且RIPpro越低此現(xiàn)象越明顯；信號相關(guān)類蛋白質(zhì)的定量多低于其mRNA預測豐度。這可能與兩類蛋白質(zhì)在肝臟中的功能活躍程度及我們在研究中采用Nobsbl校正肽段計數(shù)的蛋白質(zhì)組定量方法有關(guān)系，進一步證實RIPpro在mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性研究中的確作為

10、干擾因素存在。根據(jù)人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)注釋，明顯偏離tuRN/蛋白質(zhì)豐度趨勢線的94個(5％)蛋白質(zhì)中有95.7％為疾病相關(guān)蛋白質(zhì)，校正RIPpro的影響因素后，我們可能從中選取受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控多的蛋白質(zhì)作為候選的治療靶點。通過對24個功能類別蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)代謝類蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)相關(guān)系數(shù)明顯高于信號類蛋白質(zhì)，代謝類蛋白質(zhì)豐度的變化40％由其轉(zhuǎn)錄本豐度變化導致，而信號類蛋白質(zhì)豐度的變化只有17％

11、由其轉(zhuǎn)錄本豐度變化引起，22％由RIPpro的變化引起。這一結(jié)果提示代謝類蛋白質(zhì)受到的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控較少，代謝類基因持續(xù)穩(wěn)定的表達，對機體從節(jié)能的角度講是合理的；而信號類蛋白質(zhì)mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性差一方面由于其多為小分子的低豐度蛋白質(zhì)，采用質(zhì)譜定量引入較多的誤差所致(22.38％)，其次可能受到較多的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這對以前把不同功能類別蛋白質(zhì)二者相關(guān)性的差異籠統(tǒng)歸結(jié)為受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控程度不同的說法是一種補充。 綜上所述，本研究提出細

12、胞器聯(lián)合提取的策略，在此基礎(chǔ)上形成中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃中細胞器提取的標準操作規(guī)范(SOP)。首次成功構(gòu)建人類肝臟線粒體蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)合貝葉斯模型對所鑒定蛋白質(zhì)給出了相對明確的定位判斷，蛋白質(zhì)新定位對其功能研究提供新的參考信息。在蛋白質(zhì)組/轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)對接中，首次提出RIPpro的技術(shù)指標，對影響mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)性的多種因素進行分析，將回歸的定量研究方法引入到mRNA/蛋白質(zhì)豐度相關(guān)系數(shù)影響因素的挖掘上來。這對于其它規(guī)模化數(shù)