關于Runx2基因突變、表達調控和主要編碼蛋白異構體功能差異的研究.pdf

1、背景：骨質疏松癥是目前最影響人們生活質量的骨代謝性疾病之一，已證實骨質疏松的發(fā)病主要是成骨細胞生成減少，成骨過程活動相對減弱所致，而RUNX2是決定成骨細胞增殖分化及骨質生成的關鍵性轉錄因子。人Runx2基因多種形式的突變(包括缺失、插入、倒置突變等)與一種常染色體顯性遺傳病鎖骨顱骨發(fā)育不全綜合癥(cleidocranial dysplasia，CCD)密切相關，表現(xiàn)為全身的軟骨內成骨和膜內成骨障礙。Runx2基因在人體主要翻譯表達二種

2、蛋白異構體，Runx2-type Ⅰ(起始于P2啟動子)和Runx2-typeⅡ(起始于P1啟動子)，有研究顯示二者N'端的氨基酸序列有差異，在體內翻譯表達的時間及組織分布水平也有差異，但關于二者在人骨髓間充質干細胞(hBMSCs)向成骨細胞分化過程中是否同樣存在功能差異至今尚不明確。新近認為，植物雌激素可作為類雌激素的新型替代藥物治療婦女絕經(jīng)后骨質疏松疾病，其中白黎蘆醇/金雀異黃酮尤其具有良好的功效，但具體作用機制尚不明確，本文擬采用

3、hBMSCs細胞模型，明確Runx2是否參與白黎蘆醇/金雀異黃酮的促骨質生成效應并探索有關的信號轉導通路。人骨髓間充質干細胞是一群具備多向分化潛能的間充質干細胞，在特定條件下可以向成骨細胞分化，是研究成骨細胞分化和骨質生成的重要模型，也是臨床上治療骨組織損傷的重要細胞來源，但原代hBMSCs在骨髓中含量極低且生命周期有限，因此建立永生化hBMSCs細胞株可為有關的研究提供豐富的細胞來源。 方法：(1)將猿猴病毒40大小T抗原穩(wěn)定

4、轉入原代hBMSCs建立永生化人骨髓間充質干細胞系，檢測細胞的生命周期，生長曲線及多向分化能力，并通過免疫染色方法鑒定細胞的表面標志。(2)采用hBMSCs為細胞模型，探索白黎蘆醇/金雀異黃酮對其向成骨細胞分化的影響并查明可能參與的信號轉導通路，檢測向成骨細胞分化過程中Runx2及其下游基因Osterix、Osteocalcin mRNA表達水平的變化(Real-Time PCR方法)、成骨特異性指標ALP活性和細胞外鈣沉積量表達水平的

5、變化、MAPK通路蛋白pp44/42和pp38表達水平的變化(Westem blotting方法)。(3)通過逆轉錄病毒載體介導的RNAi方法建立穩(wěn)定只表達單個RUNX2蛋白異構體的永生化hBMSCs細胞株，檢測Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ在hBMSCs向成骨細胞分化過程中mRNA表達水平的差異(Real-Time PCR方法)，并同步檢測多項成骨特異性指標如ALP活性、細胞外鈣沉積量、骨鈣基因啟動子表達水平的變化

6、。(4)對臨床收集的3個中國CCD家系的患者，提取基因組DNA后利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增Runx2基因的所有外顯子及P1、P2啟動子序列，通過直接測序比對的方法探明是否存在突變，并對檢測到的突變在體外進行有關的功能學研究。 結果：(1)建立了永生化人骨髓間充質干細胞株，并證實其在保留了正常的細胞形態(tài)、生長曲線、細胞表面標志和多向分化潛能的同時，獲得了無限繁殖的生命力；(2)促成骨細胞分化條件下，白黎蘆醇可顯著上調Runx

7、2及其下游基因Osterix、Osteocalcin的表達，且白黎蘆醇/金雀異黃酮均可刺激MAPK通路磷酸化p44/42和p38的表達顯著增加，p44/42MAPK通路抑制劑PD98059可削弱白黎蘆醇的促成骨細胞分化效應，而p38MAPK通路抑制劑SB203580可削弱金雀異黃酮的促成骨細胞分化效應。此外雌激素受體抑制劑ICI182780也可顯著降低白黎蘆醇/金雀異黃酮的促成骨細胞分化效應；(3)Real-timePCR檢測結果顯示R

8、unx2-type Ⅰ主要在促成骨細胞分化早期起作用，可能與細胞增殖有關，Runx2-type Ⅱ主要在促成骨細胞分化晚期起作用，可能與細胞分化成熟有關；ALP活性、細胞外鈣沉積量和骨鈣基因啟動子表達水平的檢測結果進一步顯示Runx2-typeⅡ在促成骨細胞分化過程中的作用較Runx2-typeⅠ重要，尤其在促成骨細胞分化晚期；(4)在中國CCD家系中探得Runx2基因的2個單堿基突變，包括1個報道過的錯義突變(577C>T)和1個新的

9、無義突變(240G>A)。體外研究證實，577C>T突變使RUNX2蛋白193位的精氨酸替換為中止密碼子(R255X)，產(chǎn)生截短的RUNX2蛋白(64：KD→30 KD)，并喪失對骨鈣基因啟動子的激活潛能。 結論：(1)成功構建了永生化人骨髓間充質干細胞株模型，從根本上解決了原代細胞短缺和老化問題，并能夠長期地為有關的研究提供豐富的同源性細胞來源；(2)證實了植物雌激素白黎蘆醇/金雀異黃酮對hBMSCs向成骨細胞分化有促進作用，

10、且白黎蘆醇可通過刺激Runx2等成骨基因的表達及激活ER-p44/42MAPK通路產(chǎn)生促成骨細胞分化效應，而金雀異黃酮可通過ER-p38MAPK通路實現(xiàn)這一效應，這為指導臨床用藥防治骨質疏松類疾病拓開新的思路；(3)首次應用逆轉錄病毒載體介導的RNAi方法建立穩(wěn)定只表達單個RUNX2蛋白異構體的永生化hBMSCs細胞株；(4)向國內外首次提供有關Runx2-type Ⅰ和Runx2-type Ⅱ蛋白異構體在hBMSCs向成骨細胞分化過程