瘢痕疙瘩CDC2L1、RUNX3和CAMTA1基因突變的研究.pdf

1、【目的】 瘢痕疙瘩(keloid)是整形外科基礎(chǔ)研究的重要課題，其根本形成機制迄今尚未查明，尋找瘢痕疙瘩的相關(guān)調(diào)控基因已成為當前瘢痕研究的熱點之一。本課題組在前期研究中成功應(yīng)用比較基因組雜交技術(shù)(CGH)成功構(gòu)建病理性瘢痕染色體變異頻率圖譜，證實在1號染色體短臂末端存在DNA拷貝數(shù)的高頻率缺失，并通過微衛(wèi)星多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)在1p36區(qū)域存在基因雜合性缺失(LOH)，提示該區(qū)域可能存在相關(guān)瘢痕抑制基因。單核昔酸多態(tài)性(Single N

2、ucleotide Polymorlahisms，SNP)是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入或缺失等。SNP 是繼RFLP、SSR 之后的第三代分子標記。盡管原則上有 4 種核苷酸，但SNP通常具雙等位基因多態(tài)性，其突變率相當?shù)?，是一種穩(wěn)定的突變,比之前的分子標記更為有用。變性高效液相色譜分析技術(shù)(denaturing hi

3、gh performance liquid chromatography，DHPLC)是一種高通量篩選基因組DNA序列變異的新方法，在遺傳做圖和定位克隆致病基因，基因突變分析等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。DNA測序(DNA sequencing)技術(shù)是一種最為精確的分子診斷技術(shù)，在遺傳性疾病和腫瘤的診斷領(lǐng)域內(nèi)占有重要地位，目前主要應(yīng)用于鑒定基因，檢測突變，分析噬菌體文庫等方面。這兩種方法巳分別被廣泛應(yīng)用于腫瘤基因檢測，但是，兩者結(jié)合應(yīng)用于瘢痕疙

4、瘩目前國內(nèi)外尚未見報道。本課題采用變性高效液相色譜分析技術(shù)加DNA測序技術(shù)，對DNA拷貝數(shù)高頻率缺失的1p36區(qū)域的目前研究熱點基因片段RUNX3、CAMTA1 和 CDC2L1進行篩查，檢測瘢痕疙瘩相關(guān)基因突變情況，尋找可能存在的瘢痕疙瘩抑制基因并精確定位其在染色體上的位置，以期從基因水平闡明瘢痕疙瘩的發(fā)病機制，為臨床上進行有效的治療和預防奠定基礎(chǔ)。 【方法】 收集13例患者瘢痕疙瘩組織和血液標本，分別抽提出相應(yīng)基因組

5、DNA，在經(jīng)瘢痕疙瘩染色體變異頻率圖譜和微衛(wèi)星多態(tài)分析證實的DNA拷貝數(shù)高頻率缺失的1號染色體短臂末端區(qū)域，采用目前國外研究報道較多 RUNX3 基因RH120480、CAMTA1 基因 G65551、SHGC-149152 以及 CDC2L1 基因 EXON7和 EXON11 片段進行PCR擴增，回收純化后進行基因組變性高效液相色譜分析加DNA測序分析，將瘢痕組織的DNA序列分別與血液和Genebank的對應(yīng)序列進行比較、分析所檢測基

6、因片段SNP位點。 【結(jié)果】 研究顯示，所選取的五條基因片段，在血液標本中均未發(fā)現(xiàn)突變，而瘢痕疙瘩組織的相關(guān)堿基序列經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)有多個SNP位點：而且是多位點、多類型的。具體變化情況如下： (1)本研究所選取的5個基因片段 RUNX3 基因 G56267、CAMTA1 基因G65551、SHGC-149152、CDC2L1 基因 EXON7 和 EXON11，經(jīng)PCR擴增后將PCR 反應(yīng)液送 Transgenomi

7、c 公司開發(fā)的 WAVEDHPLC 系統(tǒng)檢測 DNA，DHPLC篩查結(jié)果顯示在擴增片段中出現(xiàn)雜合峰與純合峰兩種情況，血液樣品均為單個色譜峰顯示為純合鏈；瘢痕疙瘩組織樣品為雙峰則表示是雜合異源雙鏈。出現(xiàn)雜合峰顯示有突變的異源雙鏈存在。 (2)RUNX3 基因 RH120480：根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果，選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA樣本中，有12例發(fā)現(xiàn)突變，突變率為92.3％。發(fā)

8、現(xiàn)2個SNP位點，其中11例患者的第96位堿基A的缺失、12 例患者的第279位堿基的C的插入突變。瘢痕疙瘩組織中 RUNX3 基因 RH120480 片斷的突變呈多態(tài)性，為多位點、多類型基因突。 (3)CAMTA1 基因 G65551:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果，選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織 DNA 樣本中，有12例發(fā)現(xiàn)突變，突變率為92.3％。發(fā)現(xiàn)2個SNP位點，其中9例患者的第

9、54位堿基G/T的顛換、12例患者的第412位堿基的C的缺失突變。瘢痕疙瘩組織中CAMTA1基因G65551片斷的突變呈多態(tài)性，為多位點、多類型基因突變。 (4)CAMTA1 基因 SHGC-149152:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果，選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA 樣本中，有10例發(fā)現(xiàn)突變，突變率為76.9％。發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，為第178位堿基的C的缺失突變。瘢痕疙瘩組織中 C

10、AMTA1 基因 SHGC-149152片斷的突變呈多態(tài)性。 (5)CDC2L1 基因 EXON7:根據(jù) DHPLC 篩查結(jié)果，選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織DNA樣本中，有12例發(fā)現(xiàn)突變，突變率為92.3％。發(fā)現(xiàn)2個SNP位點，其中8例患者的第113位堿基G缺失、12例患者的第192位堿基的C的插入突變。瘢痕疙瘩組織中CDC2L1 基因 EXON7 片斷的突變呈多態(tài)性，為多位點、多類

11、型基因突變。 (6)CDC2L1 基因EXON11:根據(jù)DHPLC 篩查結(jié)果，選取具有代表性的雜合子和純合子樣本進行基因序列分析發(fā)現(xiàn)13例患者的瘢痕組織 DNA 樣本中，有9例發(fā)現(xiàn)突變，突變率為69.2％。發(fā)現(xiàn)1個SNP位點，為第68位堿基的A/C的顛換突變。瘢痕疙瘩組織中CDC2L1基因EXON11片斷的突變呈多態(tài)性。 【結(jié)論】 瘢痕疙瘩組織的5種基因片段中均發(fā)現(xiàn)突變。RUNX3 作為腫瘤抑制因子，該基因一旦缺