苯妥英鈉停藥對(duì)氨基酸遞質(zhì)及相關(guān)代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的影響.pdf

1、目的：近年來(lái)星形膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用正日益受到重視,而且星形膠質(zhì)細(xì)胞與癲癇的發(fā)生與發(fā)展有著密切的關(guān)系。本課題旨在通過(guò)研究苯妥英鈉(Phenytoin Sodium)慢性作用及停藥后對(duì)人星狀膠質(zhì)細(xì)胞(humanastrocytes,HA)氨基酸遞質(zhì)的釋放以及與之密切相關(guān)的多種代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響,探討星形膠質(zhì)細(xì)胞在苯妥英鈉抗癲癇機(jī)制以及停藥反跳機(jī)制中所起的作用,以期為更好地預(yù)防和控制苯妥英鈉停藥反跳以及新型抗癲癇藥物

2、的研究與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)用人星狀膠質(zhì)細(xì)胞建立苯妥英鈉慢性作用的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型。從氨基酸遞質(zhì)釋放、mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)三個(gè)水平以及停藥后0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)和60小時(shí)六個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)檢測(cè)苯妥英鈉慢性作用后快速停藥對(duì)HA細(xì)胞的影響。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(High performanceliquid chromatography,HPLC)檢測(cè)HA細(xì)胞天門冬氨酸(Aspartate,A

3、sp)、谷氨酸(Glutamatc,Glu)、天門冬酰胺(Asparatmine,Asn)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)、甘氨酸(Glycine,Gly)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的釋放量；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)與這些氨基酸代謝相關(guān)的酶及其轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平的變化,包括谷氨酸脫氫酶(GLUD1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷氨酰

4、胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC1A6)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A12)、中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A15、SLC6A19)、谷氨酸脫羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉(zhuǎn)氨酶(ABAT)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)、GA

5、BA轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GAT-3)；用western blot方法檢測(cè)谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GLUL)蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 結(jié)果：1、苯妥英鈉慢性作用可促進(jìn)HA細(xì)胞Gly和GABA的釋放,抑制Glu的釋放,而對(duì)Gln,Asn和Asp的釋放的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。停藥后Glu、Gly和GABA的釋放呈反跳樣變化。
　　 2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,苯妥英鈉慢性作用使谷氨酸脫羧酶1(G

6、AD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體l(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)mRNA相對(duì)表達(dá)量升高,使甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉(zhuǎn)氨酶(ABAT)、GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GAT-3)的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低,停藥后這些基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈反跳樣變化。谷氨酸脫氫酶(GLUD1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL

7、)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC1A6)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A12)、中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相對(duì)表達(dá)量在給藥和給藥停藥后沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。
　　 苯妥英鈉慢性給藥后及給藥停藥后,對(duì)HA細(xì)胞的GLUL蛋白的變化沒(méi)有可檢測(cè)到的影響,這與之前的氨基酸檢測(cè)、氨基酸代謝酶及相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的檢測(cè)結(jié)果相吻合。

8、　　 結(jié)論：采用HPLC檢測(cè)HA細(xì)胞在苯妥英鈉慢性作用及停藥后Asp、Glu、Asn、Gln、Gly和GABA釋放量的變化。結(jié)果顯示,苯妥英鈉慢性作用可促進(jìn)HA細(xì)胞Gly和GABA的釋放,抑制Glu的釋放,而對(duì)Asn、Asp和Gln的釋放的影響沒(méi)有顯著性意義。提示苯妥英鈉慢性作用后停藥可引起HA細(xì)胞Glu、Asp和GABA的釋放呈反跳樣變化,對(duì)Asn、Asp和Gln的釋放的影響也沒(méi)有顯著性意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,苯妥英鈉

9、慢性作用使與之相關(guān)的一些代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體如谷氨酸脫羧酶1(GAD-1)、谷氨酸脫羧酶2(GAD-2)、谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1/EAAT-2)、谷氨酸/天門冬氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLAST)mRNA相對(duì)表達(dá)量升高,甘氨酸裂解體系蛋白(GCSH)、GABA轉(zhuǎn)氨酶(ABAT)、GABA轉(zhuǎn)運(yùn)體3(GAT-3)的mRNA相對(duì)表達(dá)量降低,停藥后這些基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈反跳樣變化。提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生可能有關(guān)。谷氨酸脫氫酶(GLUD1

10、)、谷草轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷氨酰胺合成酶(GLUL)、丙酮酸羧化酶(PC)、谷氨酰胺酶(GLS)、天門冬酰胺酶(ASRGL1)、高親和力天門冬氨酸/谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC1A6)、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A12)、中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC6A15、SLC6A19)的mRNA相對(duì)表達(dá)量在給藥和給藥停藥后沒(méi)有發(fā)生顯著性變化。提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生可能沒(méi)有關(guān)系。
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11、estern blot結(jié)果顯示,苯妥英鈉慢性作用對(duì)HA細(xì)胞的GLUL蛋白表達(dá)沒(méi)有可檢測(cè)到的變化。給藥后GLUL蛋白表達(dá)與給藥組、對(duì)照組,也沒(méi)有可檢測(cè)到的差異,說(shuō)明GLUL蛋白可能與苯妥英鈉停藥反跳發(fā)生的機(jī)制無(wú)關(guān)。
　　 可見(jiàn),苯妥英鈉慢性作用后停藥可引起HA細(xì)胞Glu、Asp和GABA的釋放呈反跳樣變化,與之相關(guān)的一些代謝酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平也出現(xiàn)相應(yīng)的反跳樣變化,提示這種變化與苯妥英鈉停藥反跳的發(fā)生有關(guān)。由此推測(cè)星形膠質(zhì)