模擬缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡與MT-NAC抗凋亡機(jī)理的研究.pdf

1、本研究通過(guò)建立神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SHSY5Y)體外模擬缺血再灌(imitativeischemia-reperfusion)模型，探討神經(jīng)細(xì)胞凋亡的途徑及褪黑素(melatonin，MT)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)抗氧化、抗凋亡的作用機(jī)制，為缺血再灌注誘導(dǎo)腦神經(jīng)元凋亡的基礎(chǔ)性研究和臨床有效防治老年(血管)性癡呆(Vasculardementia，VD)提供新的理論依據(jù)。 體外常規(guī)培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)

2、胞瘤細(xì)胞株SHSY5Y，然后模擬缺血再灌注培養(yǎng)(先缺糖缺氧，后正常培養(yǎng))建立細(xì)胞模型；實(shí)驗(yàn)分正常對(duì)照組、缺氧再灌組及M/NAC藥物組；瓊脂糖凝膠電泳、流式細(xì)胞儀和透射電鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存活力；熒光比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)產(chǎn)生；HLPC檢測(cè)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸(Glutamate，Glu)的釋放；分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性和乳酸脫氫酶(lactatedeh

3、ydrogenase，LDH)活性；Westernblotting及ELISA法檢測(cè)細(xì)胞色素C(cytochromeC，Cyt.C)釋放；激光共聚焦顯微鏡及熒光比色法觀察線(xiàn)粒體跨膜壓(⊿ψm)改變。實(shí)驗(yàn)觀察模擬缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡過(guò)程是否主要通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑，褪黑素和N-乙酰半胱氨酸是否通過(guò)抗氧化、抗線(xiàn)粒體凋亡而具有神經(jīng)元保護(hù)作用。 SHSY5Y細(xì)胞在模擬缺血90min再灌24h后，瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型凋亡特征的DN

4、A片段化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)也證實(shí)有大量凋亡細(xì)胞存在，透射電鏡獲得清晰可見(jiàn)的凋亡細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)圖像；模擬缺血再灌注處理后細(xì)胞內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Glu大量釋放，比正常對(duì)照組高出70.2％(P＜0.01)；細(xì)胞內(nèi)LDH大量釋放，培養(yǎng)液中LDH活性與對(duì)照組相比增加41.7％(P＜0.01)；細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)在模擬缺血90min再灌注Omin時(shí)即明顯升高，30min時(shí)達(dá)到最高點(diǎn)，與對(duì)照組相比，P＜0.01；模擬缺血90min再灌1h后線(xiàn)粒體跨膜電

5、位明顯下降(與對(duì)照組相比，P＜0.01)，3h后迅速升高，6h后又下降，直到24h也沒(méi)有恢復(fù)；細(xì)胞色素C在模擬缺血90min再灌3h后開(kāi)始釋放，6h達(dá)到最高峰(與對(duì)照組相比，P＜0.01)，直到24h后依然維持較高水平；Caspase-3活性在缺血90min再灌0-24h內(nèi)，隨著再灌注時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，再灌12h后顯著增加，與對(duì)照組相比，P＜0.01。褪黑素和N-乙酰半胱氨酸均能顯著降低再灌組細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，降低再灌組細(xì)胞內(nèi)興奮性神