NAC對MTⅠ-Ⅱ敲除小鼠腦缺血再灌注后脾細(xì)胞損傷的影響.pdf

1、目的:
　　缺血再灌注會對機(jī)體多種臟器（包括脾臟、肝臟和腎臟）造成損傷，使得組織中有大量炎癥介質(zhì)浸潤，導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡。本研究(1)觀察金屬硫蛋白Ⅰ/Ⅱ(MetallothioneinⅠ/Ⅱ，MTⅠ/Ⅱ)敲除(Knockout，KO)小鼠的飼養(yǎng)和繁殖過程;(2)采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞法（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）建立WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注損傷模型，觀察N-乙酰半胱

2、氨酸(N-acetylcysteine，NAC)和SOD活性抑制劑二硫代氨基甲酸（diethyldithiocarbamic acid，DETC）對腦缺血再灌注后脾細(xì)胞的抗氧化作用，從免疫的角度，初步探討NAC和DETC對脾細(xì)胞作用的機(jī)制。
　　方法:
　　1.觀察MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的飼養(yǎng)和繁殖過程。
　　2.采用MCAO法建立WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血2h再灌注損傷模型。以假手術(shù)為對照，
　　(1)

3、采用五點(diǎn)法，評價(jià)WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注24h后神經(jīng)功能缺陷情況;
　　(2)觀察缺血再灌注對小鼠脾臟臟體比和腦組織供血的影響;
　　(3)采用MTT方法，檢測WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注24 h后脾細(xì)胞活力的變化，以及NAC干預(yù)2h和DETC處理2h對脾細(xì)胞活力的影響;
　　(4)檢測WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)，脾細(xì)胞及脾細(xì)胞給予NAC處理2h和DETC處理2h

4、后線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）開放程度;
　　(5)檢測WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注24 h時(shí)間點(diǎn)，脾細(xì)胞及脾細(xì)胞給予NAC2 h和DETC處理2h后線粒體Ca2+攝取釋放情況;
　　(6)用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測定試劑盒，檢測WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注24h后LDH漏

5、出率的變化，以及NAC和DETC處理2h的作用。
　　結(jié)果:
　　1.MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠與野生鼠比較生殖能力要低一些，喜靜，容易長腫物，對缺水耐受性低。
　　2.NAC對腦缺血再灌注損傷MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠脾細(xì)胞的影響
　　(1)腦缺血再灌注24小時(shí)，WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺陷。
　　(2)缺血再灌注影響了小鼠腦組織的正常供血，導(dǎo)致部分缺血;且導(dǎo)致小鼠的脾臟體比下降，而金屬硫蛋

6、白在一定程度上抑制了缺血再灌注對脾臟體比的影響。
　　(3)無論是WT還是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，與假手術(shù)對照組相比，缺血再灌注組對照組的脾細(xì)胞活力顯著下降(P＜0.01);與缺血再灌注對照組相比，NAC干預(yù)后，脾細(xì)胞活力均顯著增強(qiáng)（P＜0.01）。與WT相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注后，脾細(xì)胞活力降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而MT-Ⅰ/ⅡKO缺血再灌注后經(jīng)過NAC干預(yù)后，脾細(xì)胞活力增加的強(qiáng)度比WT低，差異具有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DETC處理抑制了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的脾細(xì)胞的活力(P＜0.01);DETC處理進(jìn)一步抑制了WT(P＜0.05)和MT-Ⅰ/Ⅱ KO(P＜0.01)小鼠腦缺血再灌注后的脾細(xì)胞的活力;DETC對MT-Ⅰ/ⅡKO小鼠的抑制作用比對WT小鼠的大。
　　(4)無論是WT還是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，與假手術(shù)對照組相比，缺血再灌注組的OD540值降低，mPTP開放程度增大(P＜0.01);與缺血再灌注對照組

8、相比，缺血再灌注NAC處理組的OD540值增加，mPTP開放程度減?。≒＜0.01）。與WT缺血再灌注對照組相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注對照組的OD540值降低，mPTP開放程度增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC處理組的OD540值比WT缺血再灌注NAC處理組的低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。DETC處理對WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠假手術(shù)組和缺血再灌注組的mPTP開放程度均沒有

9、顯著影響(P＞0.05)。
　　(5)無論是WT還是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，與假手術(shù)對照組相比，缺血再灌注組的OD值增高，Ca2+超載程度加深(P＜0.01);與缺血再灌注對照組相比，缺血再灌注NAC處理組的OD值降低，Ca2+超載程度較低(P＜0.01)。與WT缺血再灌注對照組相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注對照組的OD值較高， Ca2+超載程度加深，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC處理

10、組的OD值、Ca2+超載程度比WT缺血再灌注NAC處理組的高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DETC處理對WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠假手術(shù)組和缺血再灌注組的Ca2+超載程度均沒有顯著影響(P＞0.05)。
　　(6)無論是WT還是MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠，與假手術(shù)對照組相比，缺血再灌注組的乳酸脫氫酶漏出率增高(P＜0.01);與缺血再灌注對照組相比，缺血再灌注NAC處理組的乳酸脫氫酶漏出率降低(P＜0.01)。與WT缺血再灌

11、注對照組相比，MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注對照組的乳酸脫氫酶漏出率較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而MT-Ⅰ/Ⅱ KO缺血再灌注NAC處理組的乳酸脫氫酶漏出率比WT缺血再灌注NAC處理組的高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。DETC處理促進(jìn)了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠的乳酸脫氫酶的漏出(P＜0.01);DETC處理進(jìn)一步促進(jìn)了WT和MT-Ⅰ/Ⅱ KO小鼠腦缺血再灌注后的乳酸脫氫酶的漏出(P＜0.01);DETC對MT-Ⅰ