人HSP70D的表達純化及其免疫佐劑樣效應研究.pdf

1、在該研究中,我們采用原核表達系統(tǒng),對人HSP70D分子進行大規(guī)模的表達純化,旨在建立一種新的HSP70純化的方式,研究所純化的人HSP70D的佐劑樣效應,并將其應用于腫瘤的免疫治療.為了獲得足夠數量及符合臨床試驗要求的重組人HSP70,我們在前一部分實驗完成了基因工程人HSP70D的高表達菌種的構建及篩選的基礎上,對其發(fā)酵表達條件及純化條件進行優(yōu)化,確定最佳的條件和方法,建立穩(wěn)定、可靠的生產工藝.首先通過搖床發(fā)酵實驗我們觀察了不同的培養(yǎng)

2、基包括LB、2YT、SOB、SOC、M9CA培養(yǎng)基對工程菌生長及重組HSP70D蛋白表達量的影響.該工程菌采用的載體pET24a以T7作為啟動子,它受LacI表達的阻蛋白的抑制.由于LacI的存在限制了外源基因的持續(xù)、高水平的表達,對宿主菌起到穩(wěn)定作用.但誘導劑IPTG可以消除LacI表達阻遏蛋白對外源基因表達抑制.不同濃度IPTG加入后,對目的蛋白的表達會產生一定的影響.通過小量發(fā)酵實驗,我們探討了不同IPTG濃度對rhHSP70表達

3、量的影響,并觀察了不同誘導時間后rhHSP70D的表達量.綜上所述,該研究克隆了人HSP70D的全長cDNA并構建了人HSP70D的原核表達載體,篩選出高表達rhHSP70D的工程菌,建立了rhHSP70D的表達純化的中試工藝,對獲得的rhHSP70D的體外生物學活性及佐劑樣效應進行了研究,證實了我們表達純化的rHSP70D具備經典HSP70的特征和功能,即能與抗原肽結合和佐劑樣效應,質控指標均達到中國生物制品規(guī)程的有關要求,有望作為一