山地烏骨雞IL—1β基因克隆測序及對IBV DNA疫苗免疫佐劑效應研究.pdf

1、本文根據(jù)Genebank中雞白介素-1β(ChIL-Iβ)序列(Y15006)設計引物對，采用RT-PCR法從地方品種山地烏骨雞的外周血淋巴細胞RNAq中克隆TChIL-1β基因，將cDNA片段克隆到PMD18-T載體，進行序列測定，并對其進行分析。山地烏骨雞IL-1β序列在國內(nèi)外是第四個報道的雞IL-Iβ序列。分析結果顯示：該克隆的cDNA全長804bp，編碼267個氨基酸。將山地烏骨雞IL-Iβ基因測序結果與Genebank上的僅有

2、的1株IL-1β序列(Weining，K.C.等報道的序列)用DNAstar進行分析發(fā)現(xiàn)序列同源性99.5％，與國內(nèi)邵衛(wèi)星等報道的IL-1β序列同源性為99.0％，與張永霞等報道的IL-1β基因序列同源性為97.9％，將其編碼的氨基酸進行同源性分析，同時將4個核苷酸序列進行進化樹分析。該基因經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后，插入同樣經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切真核表達載體pcDNA3.1(+)中，構建真核表達質(zhì)粒，經(jīng)鑒定正確，

3、配制分子佐劑pDNAIL-1β，與IBV DNA疫苗聯(lián)合免疫7組雞(paDNA3.1組，IBV DNA組，pDNAIL-1β組，pDNAIL-1β　+IBV DNA組，PBS組，滅活苗組，弱毒苗組)。 采用間接ELISA測定特異性抗體，結果表明，免疫14天時pDNAIL-1β+DNA組和弱毒菌組、滅活苗組比較差異極顯著(P<0.01)，在21天pDNAIL-1β+IBV DNA組與所有實驗組比較差異極顯著(P<0.01)，在28

4、天pDNAIL-1β+DNA組與DNA疫苗組比較差異顯著(P<0.05)；測定CD3+T淋巴細胞結果表明，pDNAIL-1β+IBV DNA組與IBV DNA疫苗組比較在14天差異極顯著(P<0.01)，21天時pDNAIL-1β+IBV DNA組與IBV DNA疫苗組比較差異顯著(P<0.05)，pDNAIL-1β+IBV DNA組與其它實驗組比較均出現(xiàn)差異極顯著(P<0.01)；檢測CD4+T淋巴細胞結果表明，7天時pDNAIL-1

5、β+IBV DNA組與pcDNA3.1組、滅活苗組、弱毒苗組和PBS苗組比較差異顯著(P<0.05)，在14-21天期間pDNAIL-1β+IBV DNA組與IBV DN疫苗組比較，差異極顯著(P<0.01);研究CD8+結果表明，在免疫14天，pDNAIL-1β+IBV DNA組和IBV DNA疫苗組比較差異極顯著(P<0.01)，21天時與除DNA疫苗組外的其它五個實驗組比較差異顯著(P<0.05)。 攻毒實驗結果表明，pD