四川山地烏骨雞IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆測序及分子佐劑效應研究.pdf

1、雞白細胞介素2(IL-2)、IL-15、IL-18及干擾素-γ(IFN-γ)是雞體內(nèi)重要的細胞因子，在雞抗病和免疫應答反應中有重要作用。四川山地烏骨雞是地方優(yōu)良品種，具有生長快，適應性廣、抗病力強等特點。目前有關四川山地烏骨雞的IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ及其免疫學特性的研究，國內(nèi)外均未見報道?？寺∷拇ㄉ降貫豕请uIL-2、1L-15、IL-18及IFN-γ基因，研制分子免疫佐劑及其對疫苗的佐劑效應，提高疫苗免疫應答，有重

2、要學術(shù)價值和應用前景。 1.本試驗用RT-PCR方法從conA刺激的四川山地烏骨雞的外周血淋巴細胞總RNA擴增了雞白細胞介素2及γ-干擾素基因的cDNA。將分離的cDNA片段克隆到PMD18-T載體，進行序列測定分析。結(jié)果表明：雞IL-2基因全部的開放閱讀框432bp，與Genbank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)：山地烏骨雞IL-2基因與其他品種雞IL-2基因核苷酸同源性為98.4-99.5％。雞IFN-γ基因全部的開放閱讀

3、框495bp，與GeneBank上報道的核苷酸序列同源性為97.4％-100％。四川山地烏骨雞IL-2和IFN-γ克隆在國內(nèi)外尚未見報道，本試驗所克隆的雞IL-2及IFN-γ基因，豐富了IL-2及IFN-γ基因的資源庫，為進一步研究提供了基礎材料。 2.用RT-PCR方法從conA刺激四川山地烏骨雞的脾淋巴細胞總RNA擴增了雞白細胞介素15基因的cDNA。將分離cDNA片段的克隆到PMD18-T載體，進行序列測定分析。結(jié)果表明：

4、雞IL-15基因基因全部的開放閱讀框564bp，與Genbank上序列比較發(fā)現(xiàn)，山地烏骨雞IL-15與其他序列同源性為98.9-99.8％。目前很少關于雞IL-15的研究報道，四川山地烏骨雞IL-15克隆在國內(nèi)外尚未見報道，本試驗為進一步研究雞IL-15的疫苗佐劑效應奠定的基礎。 3.本研究應用RT-PCR方法從conA刺激2h后四川山地烏骨雞的脾臟組織總RNA擴增了IL-18基因的cDNA，將分離cDNA片段的克隆到PMD18

5、-T載體，進行序列測定分析。結(jié)果表明：雞IL-18基因全部的開放閱讀框597bp，與GeneBank上報道的核苷酸序列同源性為96.5-100％。其中與Schneider等報道的序列完全一致。四川山地烏骨雞IL-18克隆在國內(nèi)外尚未見報道，本研究為雞IL-18疫苗佐劑效應的研究提供了物質(zhì)基礎。 4.分別雙酶切得到IL-2、IFN-γ、IL-15、IL-18DNA片段，將其亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+)上。通過菌落PC

6、R方法在轉(zhuǎn)化子中篩選陽性克隆，并雙酶切鑒定重組子。其中IL-15真核質(zhì)粒的構(gòu)建在國內(nèi)尚未見報道，其中雞IFN-γ及IL-18真核表達質(zhì)粒申請了國家發(fā)明專利，專利申請?zhí)柗謩e為：2005100213545和200510021355x。用本研究構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒，制備分子佐劑，為進一步研究提供基礎材料。 5.將1日齡非免疫健康雛雞240只，分組9組，肌肉免疫(A組：空白對照，B組：空質(zhì)粒pcDNA3.1，C組：IBVDNA疫苗，D組：

7、IBVDNA-pDNAIL118，E組：Liposome/IBVDNA，F(xiàn)組IBVDNA-pDNAIL12，G組Liposome/IBVDNA-pDNAIL2，H組IBVDNA-pDNAIFN-γ，I組IBVDNA-pDNAIL15，前兩組每組20只雞，后面各組每組25只雞。)通過檢測血清總IgG值、IBV特異性抗體、CD4+、CD8+百分含量，分析了pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDNAIFN-γ對IBVDNA的

8、免疫佐劑效應及脂質(zhì)體對pDNAIL12作用的影響。結(jié)果表明：免疫后5-29d，D、F、H、I組血清總IgG值及CD4+/CD8+百分含量都高于C組，呈差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)?？侷gG值：I組＞D組＞F組＞H組＞C組。D組CD4+百分含量在免疫后21d顯著高于F，H，I組(P＜0.05)。CD4+百分含量為：D組＞I組＞H組＞F組＞C組。免疫后29d，且D、H、I組CD8+百分含量顯著高于F組(P＜0.05)。對

9、CD8+免疫效果比較發(fā)現(xiàn)：I組＞H組＞D組＞F組＞C組。D、F、I組特異性抗體水平于免疫后5-29d均高于C組，H組在5-15d低于C組，到21d約高于C組。G組血清總IgG值、IBV特異性抗體水平、CD4+、CD8+百分含量均高于F組，呈差異顯著(P＜0.05)或極顯著性(P＜0.01)。攻毒結(jié)果顯示D、F、H、I，組死亡率，顯著低于A、B、C組。G組死亡率低于F組。結(jié)果表明：pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDN

10、AIFN-γ能提高IBV免疫的細胞和體液免疫水平及攻毒保護率，對IBVDNA疫苗有免疫佐劑效應。陽離子脂質(zhì)體包裹pDNAIL-2后，可提高實驗對疫苗的細胞免疫和體液免疫水平及攻毒保護率。雞IL15和IFN-γ的真核質(zhì)粒免疫佐劑效應、四種分子佐劑對IBVDNA的佐劑效應的比較研究尚未見報道。對CD4+和CD8+亞類百分含量來測定細胞免疫水平較少應用于雞免疫實驗中。本試驗對pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18及pDNAIFN-

11、γ的免疫佐劑效應的比較研究，對于尋找DNA疫苗的分子免疫佐劑及不同分子佐劑之間的聯(lián)合應用提供了科學依據(jù)。 6.將1日齡非免疫健康雛雞60只，分3組，頸部肌肉注射進行免疫(A組禽流感滅活疫苗(AI)，B組AI-pDNAIL-2，C組AI-pDNAIL15)，通過檢測CD4+、CD8+含量及HI抗體，分析了pDNAIL-2和pDNAIL-15對禽流感滅活疫苗佐劑效應。結(jié)果表明：B組和C組CD4+、CD8+百分含量及HI抗體水平均高于

12、A組。B組、C組于免疫后10-23dHI抗體顯著高于A組(P＜0.05)，C組HI抗體于免疫后16d顯著高于A組、B組(P＜0.05)。且B組、C組HI抗體水平比A組提前5d達到5log2。免疫后10d后，C組CD4+淋巴細胞百分含量顯著高于A組、B組(P＜0.05)。免疫后23d，B組CD4+淋巴細胞百分含量顯著高于C組、A組(P＜0.05)。結(jié)果表明：pDNAIL2和pDNAIL15對禽流感滅活苗具有免疫佐劑效應，且pDNAIL15