四川山地烏骨雞IL-2、15、18、IFN-γ基因克隆測(cè)序及分子佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、雞白細(xì)胞介素2(IL-2)、IL-15、IL-18及干擾素-γ(IFN-γ)是雞體內(nèi)重要的細(xì)胞因子，在雞抗病和免疫應(yīng)答反應(yīng)中有重要作用。四川山地烏骨雞是地方優(yōu)良品種，具有生長(zhǎng)快，適應(yīng)性廣、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)。目前有關(guān)四川山地烏骨雞的IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ及其免疫學(xué)特性的研究，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道?？寺∷拇ㄉ降貫豕请uIL-2、1L-15、IL-18及IFN-γ基因，研制分子免疫佐劑及其對(duì)疫苗的佐劑效應(yīng)，提高疫苗免疫應(yīng)答，有重

2、要學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。 1.本試驗(yàn)用RT-PCR方法從conA刺激的四川山地烏骨雞的外周血淋巴細(xì)胞總RNA擴(kuò)增了雞白細(xì)胞介素2及γ-干擾素基因的cDNA。將分離的cDNA片段克隆到PMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明：雞IL-2基因全部的開(kāi)放閱讀框432bp，與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)：山地烏骨雞IL-2基因與其他品種雞IL-2基因核苷酸同源性為98.4-99.5％。雞IFN-γ基因全部的開(kāi)放閱讀

3、框495bp，與GeneBank上報(bào)道的核苷酸序列同源性為97.4％-100％。四川山地烏骨雞IL-2和IFN-γ克隆在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)所克隆的雞IL-2及IFN-γ基因，豐富了IL-2及IFN-γ基因的資源庫(kù)，為進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)材料。 2.用RT-PCR方法從conA刺激四川山地烏骨雞的脾淋巴細(xì)胞總RNA擴(kuò)增了雞白細(xì)胞介素15基因的cDNA。將分離cDNA片段的克隆到PMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明：

4、雞IL-15基因基因全部的開(kāi)放閱讀框564bp，與Genbank上序列比較發(fā)現(xiàn)，山地烏骨雞IL-15與其他序列同源性為98.9-99.8％。目前很少關(guān)于雞IL-15的研究報(bào)道，四川山地烏骨雞IL-15克隆在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究雞IL-15的疫苗佐劑效應(yīng)奠定的基礎(chǔ)。 3.本研究應(yīng)用RT-PCR方法從conA刺激2h后四川山地烏骨雞的脾臟組織總RNA擴(kuò)增了IL-18基因的cDNA，將分離cDNA片段的克隆到PMD18

5、-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定分析。結(jié)果表明：雞IL-18基因全部的開(kāi)放閱讀框597bp，與GeneBank上報(bào)道的核苷酸序列同源性為96.5-100％。其中與Schneider等報(bào)道的序列完全一致。四川山地烏骨雞IL-18克隆在國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究為雞IL-18疫苗佐劑效應(yīng)的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。 4.分別雙酶切得到IL-2、IFN-γ、IL-15、IL-18DNA片段，將其亞克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上。通過(guò)菌落PC

6、R方法在轉(zhuǎn)化子中篩選陽(yáng)性克隆，并雙酶切鑒定重組子。其中IL-15真核質(zhì)粒的構(gòu)建在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道，其中雞IFN-γ及IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利，專利申請(qǐng)?zhí)柗謩e為：2005100213545和200510021355x。用本研究構(gòu)建的真核表達(dá)質(zhì)粒，制備分子佐劑，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)材料。 5.將1日齡非免疫健康雛雞240只，分組9組，肌肉免疫(A組：空白對(duì)照，B組：空質(zhì)粒pcDNA3.1，C組：IBVDNA疫苗，D組：

7、IBVDNA-pDNAIL118，E組：Liposome/IBVDNA，F(xiàn)組IBVDNA-pDNAIL12，G組Liposome/IBVDNA-pDNAIL2，H組IBVDNA-pDNAIFN-γ，I組IBVDNA-pDNAIL15，前兩組每組20只雞，后面各組每組25只雞。)通過(guò)檢測(cè)血清總IgG值、IBV特異性抗體、CD4+、CD8+百分含量，分析了pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDNAIFN-γ對(duì)IBVDNA的

8、免疫佐劑效應(yīng)及脂質(zhì)體對(duì)pDNAIL12作用的影響。結(jié)果表明：免疫后5-29d，D、F、H、I組血清總IgG值及CD4+/CD8+百分含量都高于C組，呈差異顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)。總IgG值：I組＞D組＞F組＞H組＞C組。D組CD4+百分含量在免疫后21d顯著高于F，H，I組(P＜0.05)。CD4+百分含量為：D組＞I組＞H組＞F組＞C組。免疫后29d，且D、H、I組CD8+百分含量顯著高于F組(P＜0.05)。對(duì)

9、CD8+免疫效果比較發(fā)現(xiàn)：I組＞H組＞D組＞F組＞C組。D、F、I組特異性抗體水平于免疫后5-29d均高于C組，H組在5-15d低于C組，到21d約高于C組。G組血清總IgG值、IBV特異性抗體水平、CD4+、CD8+百分含量均高于F組，呈差異顯著(P＜0.05)或極顯著性(P＜0.01)。攻毒結(jié)果顯示D、F、H、I，組死亡率，顯著低于A、B、C組。G組死亡率低于F組。結(jié)果表明：pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18和pDN

10、AIFN-γ能提高IBV免疫的細(xì)胞和體液免疫水平及攻毒保護(hù)率，對(duì)IBVDNA疫苗有免疫佐劑效應(yīng)。陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹pDNAIL-2后，可提高實(shí)驗(yàn)對(duì)疫苗的細(xì)胞免疫和體液免疫水平及攻毒保護(hù)率。雞IL15和IFN-γ的真核質(zhì)粒免疫佐劑效應(yīng)、四種分子佐劑對(duì)IBVDNA的佐劑效應(yīng)的比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)CD4+和CD8+亞類百分含量來(lái)測(cè)定細(xì)胞免疫水平較少應(yīng)用于雞免疫實(shí)驗(yàn)中。本試驗(yàn)對(duì)pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18及pDNAIFN-

11、γ的免疫佐劑效應(yīng)的比較研究，對(duì)于尋找DNA疫苗的分子免疫佐劑及不同分子佐劑之間的聯(lián)合應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。 6.將1日齡非免疫健康雛雞60只，分3組，頸部肌肉注射進(jìn)行免疫(A組禽流感滅活疫苗(AI)，B組AI-pDNAIL-2，C組AI-pDNAIL15)，通過(guò)檢測(cè)CD4+、CD8+含量及HI抗體，分析了pDNAIL-2和pDNAIL-15對(duì)禽流感滅活疫苗佐劑效應(yīng)。結(jié)果表明：B組和C組CD4+、CD8+百分含量及HI抗體水平均高于

12、A組。B組、C組于免疫后10-23dHI抗體顯著高于A組(P＜0.05)，C組HI抗體于免疫后16d顯著高于A組、B組(P＜0.05)。且B組、C組HI抗體水平比A組提前5d達(dá)到5log2。免疫后10d后，C組CD4+淋巴細(xì)胞百分含量顯著高于A組、B組(P＜0.05)。免疫后23d，B組CD4+淋巴細(xì)胞百分含量顯著高于C組、A組(P＜0.05)。結(jié)果表明：pDNAIL2和pDNAIL15對(duì)禽流感滅活苗具有免疫佐劑效應(yīng)，且pDNAIL15