南沙珠江河口地區(qū)水體及海（水）產(chǎn)品中致病性弧菌污染狀況調(diào)查及分子生物學(xué)研究.pdf

1、研究意義： 致病性弧菌是一群氧化酶陽性、具有動力的革蘭陰性兼性厭氧菌，廣泛分布于海水、淡水、海產(chǎn)品中，尤以近?？?、河口多見，人類攝入或接觸污染的水源和食物易引起感染。致病性弧菌包含一大類共約12種弧菌，所致疾病的種類和毒性差別很大，其中最重要的，也是對人類、漁業(yè)影響最大的是O1型霍亂弧菌、非O1型霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌。近年來，致病性弧菌已成為夏秋季急性感染性腹瀉的重要、常見病原菌。 大量研究表明，在我國江、河、

2、湖、海各種水體中均有霍亂弧菌、副溶血弧菌等致病性弧菌存在，致病性的流行菌株通過污染海、水產(chǎn)品等引起人間疫情。大量研究結(jié)果表明我國各、地的幾乎每個省份，無論是咸、淡水及地表養(yǎng)殖水等水系中，還是海(水)產(chǎn)品，均可能有霍亂弧菌生長繁殖，且不同程度地存在流行株和產(chǎn)毒株，廣州市多次在黃沙水產(chǎn)市場、珠江內(nèi)外航道檢出霍亂弧菌；而副溶血弧菌更是嚴(yán)重污染水體和海(水)產(chǎn)品，有資料，我國華東沿海地區(qū)該菌的檢出率高達(dá)57.4％～66.5％，夏秋季更嚴(yán)重，成為

3、造成食物中毒的嚴(yán)重隱患，同時由于美國和歐盟對進(jìn)口水產(chǎn)品副溶血弧菌的強制檢驗，對我國水產(chǎn)品出口造成障礙。 珠江河口地區(qū)水網(wǎng)豐富，為咸淡水交界，水質(zhì)、溫度很適宜霍亂等致病性弧菌生長。南沙是珠江入?？谥?，圍海造田形成19條河涌，較適宜養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)魚蝦蟹，水產(chǎn)品資源豐富。歷史上均曾發(fā)生過水型霍亂流行，九十年代一直有散發(fā)病例。在以往發(fā)生的食物中毒，已有多次證實為副溶血弧菌所致。 2005年起，雖擴大了對水樣、海水產(chǎn)品中霍亂弧菌的監(jiān)測

4、力度，但霍亂弧菌檢出率一直較低。與霍亂低發(fā)地區(qū)水體、海(水)產(chǎn)品的較高檢出率的結(jié)果有較大差異。且目前尚無對該地區(qū)以霍亂弧菌、副溶血弧菌為代表的致病性弧菌的分布特征、生態(tài)學(xué)進(jìn)行研究的報道。 因此，了解霍亂弧菌、副溶血弧菌在南沙河海口地區(qū)的分布情況及其致病規(guī)律，掌握致病性弧菌的生態(tài)特征，對于預(yù)防該菌群感染，保障食品衛(wèi)生具有重要的現(xiàn)實意義。 研究目的： 1.掌握珠江河海口水網(wǎng)地區(qū)霍亂弧菌、副溶血弧菌在不同方位、深度的水

5、域及海(水)產(chǎn)品中的分布情況及其毒力基因攜帶特征： 2.分析環(huán)境中霍亂弧菌與歷史病例分布的關(guān)系以及外環(huán)境中其它致病性弧菌的存在情況與腹瀉病人發(fā)生的關(guān)系。 研究內(nèi)容： 1.研究不同部位、季節(jié)水體的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。 2.研究(海)水產(chǎn)品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。 3.研究淤泥、土壤等外環(huán)境中的霍亂弧菌、副溶血弧菌的感染情況。 5.研究副溶血弧菌毒力基因耐熱直接溶血素T

6、DH的攜帶情況； 6.研究外環(huán)境中的霍亂弧菌及與既往病例中檢出的霍亂弧菌的分子相關(guān)關(guān)系。 材料與方法： 1.樣品種類： 水體(河涌水、海水)及河涌淤泥、水生植物的樣品；甲殼類(蝦、蟹)、貝殼類(蛤、牡蠣、貝殼)及魚、蛙等海(水)產(chǎn)品；海(水)產(chǎn)品養(yǎng)殖水。 2.采樣時間 水體及外環(huán)境采樣分別在漲潮、退潮時進(jìn)行，海(水)產(chǎn)品及養(yǎng)殖水的采集在每月上旬完成。根據(jù)水文情況設(shè)計每次采樣時間。

7、3.采樣頻次與數(shù)量本研究采樣檢測為期一年。水樣采樣每月一次，每次共50份。養(yǎng)殖水樣每月檢測一次，每次10個海(水)產(chǎn)品每月檢測一次，每次計20份。 4.采樣方法按照相關(guān)技術(shù)規(guī)范實施。 5.霍亂弧菌培養(yǎng)分離鑒定按照GB15984-1995操作，副溶血性弧菌培養(yǎng)分離鑒定按照GB/T4789-2003操作。采用PCR方法監(jiān)測霍亂弧菌、副溶血弧菌毒力基因攜帶情況；采用PFGE法對既往暴發(fā)疫情病例分離菌株與本研究環(huán)境分離霍亂菌株進(jìn)

8、行聚類分析。VP定量分析按照GB/T4789-2003進(jìn)行。 結(jié)果： 1.一般情況 共采集了各類樣品840件，其中海水300份，河涌水樣300份，養(yǎng)殖水168份，淤泥、水草各180份，魚類96件、貝殼類72件、甲殼類48件、其他類(蛙、)24件。 2.共發(fā)現(xiàn)4宗霍亂弧菌污染的樣品，總陽性率為0.48％。4株霍亂弧菌均為O1群稻葉型，毒力基因監(jiān)測均為陰性，且均為非流行株。 3.PFGE聚類分析表明外

9、環(huán)境分離菌株與2005年暴發(fā)疫情病例分離菌株集中表現(xiàn)為3種高度相近的PFGE型。環(huán)境分離菌株與病例分離菌株的相似度約84.2~87.4％，而環(huán)境分離株之間相似都約87.4～98.2％。 4.本研究副溶血弧菌總陽性率為36.25％；水產(chǎn)品的陽性率為47.50％，水體總陽性率為25.78％，淤泥和水草等環(huán)境樣本51.11％。 5.海產(chǎn)品中，貝殼類水產(chǎn)品VP污染率最高61.11％，其次為甲殼類56.25％，其他類最低為33.3

10、3％。陽性樣品平均密度以甲貝類最高，為1938.4MPN/100g，其次為貝殼類1810.77MPN/100g，魚類的陽性樣本平均密度最低，為1247.53％。 6.不同水體Vp污染率表現(xiàn)為海水(63.30％)>河涌水(45.36％)>養(yǎng)殖水(38.29％)，，陽性樣品平均密度卻表現(xiàn)為海水產(chǎn)品及環(huán)境(2005.6±134.6)>養(yǎng)殖水(1745.78±212.1)>河涌水(1488.57±102.22)。 7.不同水體海

11、產(chǎn)品VP污染率表現(xiàn)為海水產(chǎn)品(65.31％)>河涌水產(chǎn)品(39.19％)>養(yǎng)殖水產(chǎn)品(30.88％)，陽性樣品平均密度卻表現(xiàn)出：海水產(chǎn)品及環(huán)境(1942.74±153.6)>養(yǎng)殖水(1704.5±98.7)>河涌水(1308.7±112.3)。 8.海水、養(yǎng)殖水、河涌水的Vp污染率均表現(xiàn)為深層(32.38％)>表層(19.75％)。陽性樣品的平均密度也是深層水樣(1921.6±97.4)高于表層水樣。 9.海水退潮時vp

12、污染情況(35.83％)比漲潮(24.17％)時嚴(yán)重，河涌水結(jié)果相似，退潮時Vp污染情況(39.44％)高于漲潮時(17.78％)。 10.海產(chǎn)品、水體、淤泥與水草的VP污染率均表現(xiàn)為6～8月最高，而12～2月則陽性率較低，而且，陽性樣品平均密度也表現(xiàn)為6～8月最高。 11.本次調(diào)查水體的pH和鹽度范圍內(nèi)(pH范圍在7.1～7.9；水體鹽度范圍為0～3.5％)，海產(chǎn)品、海水、淤泥的Vp污染率以及海產(chǎn)品、海水陽性樣品平均密

13、度與水體pH和鹽度呈正相關(guān)關(guān)系。 12.對120株菌株進(jìn)行Vp毒力基因tdh檢測，從海產(chǎn)品來源菌株中檢出tdh陽性1株，淤泥來源菌株中檢出tdh陽性1株，其余均為tdh陰性。 結(jié)論： 1、南沙珠江河口地區(qū)海產(chǎn)品、海水等外環(huán)境中存在霍亂弧菌，但檢出率較低；且均為非流行株，不攜帶毒力基因。 2、外環(huán)境分離霍亂菌株之間，以及與既往暴發(fā)疫情病例分離菌株之間存在高度遺傳相關(guān)性。 3、南沙珠江河口地區(qū)海產(chǎn)品、