Fox01對(duì)游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗和脂質(zhì)堆積作用的研究.pdf

1、背景與目的：
　　 2型糖尿病(T2DM)是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題,在國內(nèi)外都有很高的發(fā)病率。中國糖尿病協(xié)會(huì)最新調(diào)查發(fā)現(xiàn),糖尿病在中國的發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到了9.7％。全國糖尿病人接近一個(gè)億,中國已成為全球范圍糖尿病增長(zhǎng)最快的地區(qū)。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是T2DM發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要特征,IR不僅是T2DM發(fā)病的重要原因,也是高血壓、多囊卵巢綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的危險(xiǎn)因素。近年來,IR在

2、T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用已成為糖尿病發(fā)病機(jī)制研究中的一個(gè)熱點(diǎn)課題。
　　 非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是2型糖尿病患者最常合并的肝損傷,目前所公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是由胰島素抵抗和氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、炎性細(xì)胞因子釋放形成的“二次打擊”學(xué)說,因此,改善胰島素抵抗和氧化應(yīng)激從理論上可以對(duì)脂肪肝起到保護(hù)作用。NAFLD中出現(xiàn)的IR存在兩種途徑:(1)持續(xù)脂質(zhì)堆積,肝臟繼發(fā)代謝

3、紊亂,導(dǎo)致肝臟及全身胰島素抵抗；(2)脂肪因子之間不平衡誘導(dǎo)胰島素抵抗出現(xiàn)。高脂飲食模型和體外試驗(yàn)中脂肪酸干預(yù)肝細(xì)胞可產(chǎn)生胰島素抵抗和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。
　　 FoxOl是FoxO亞家族中發(fā)現(xiàn)最早的成員,廣泛表達(dá)于成人的各組織器官中,包括下丘腦、肌肉組織、脂肪組織、肝臟等。在空腹?fàn)顟B(tài)下,肝臟是血糖水平維持的主要器官,FoxOl是促進(jìn)糖異生酶表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子?？崭辜安秃蟾哂坞x脂肪酸血癥也是胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的一個(gè)顯著代謝紊亂的特征。

4、>　　 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding:proteins lc,SREBP-lc)在NAFLD的發(fā)病中起重要的作用,是脂肪形成基因的總調(diào)節(jié)器,也是肝臟中調(diào)節(jié)脂肪生成的重要的轉(zhuǎn)錄因子,與甘油三脂的形成關(guān)系密切。脂肪肝和胰島素抵抗關(guān)系的分子機(jī)制還沒有清晰定義,有研究表明,在RXR／LXR模型中,SREBP-lc表達(dá)被FOXOl負(fù)向調(diào)節(jié)。
　　 本實(shí)驗(yàn)采用高濃度軟脂酸誘導(dǎo)人肝

5、癌細(xì)胞株成肝脂肪變模型,抑制FoxOl進(jìn)行干預(yù),探討FoxOl對(duì)肝脂肪變細(xì)胞的作用,以期為治療防治NALDH、減輕胰島素抵抗提供新的靶點(diǎn)和依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.采用高濃度游離脂肪酸(5×10-4mol／L)誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞24h,建立IR細(xì)胞并脂肪變肝臟細(xì)胞模型。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:對(duì)照組(普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞組)；軟脂酸組(含5×10-4mol／L軟脂酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)的HepG2細(xì)

6、胞組)；空白質(zhì)粒組(含5×10-4mol／L軟脂酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組)；FoxOlsiRNA載體組(含5×10-4mol／L軟脂酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染pSIREN-DNR-DsRed—Express-FoxOl質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞組)。當(dāng)細(xì)胞處于80％～90％融合時(shí)按照Lipofectamine2000說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。
　　 3.熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,FoxOl siRNA載體攜帶紅色熒光標(biāo)記,在

7、轉(zhuǎn)染后于熒光顯微鏡下觀查細(xì)胞內(nèi)紅色熒光的表達(dá)量,評(píng)估質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的情況。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxOlmRNA的表達(dá)；
　　 4.轉(zhuǎn)染后24h,計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度,各實(shí)驗(yàn)組均傳代一次,在含有10-9 mol／L胰島素的培養(yǎng)液中孵育24h后,MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖率減少實(shí)驗(yàn)誤差,采用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)各組培養(yǎng)基中葡萄糖含量,以不鋪細(xì)胞的空白孔為對(duì)照,計(jì)算24h葡萄糖消耗量。
　　 5.油紅O染色普通顯微鏡下觀察細(xì)

8、胞脂質(zhì)堆積情況。
　　 6.采用RT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù),檢測(cè)SREBP-lc mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)。
　　 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS12.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)所得數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的建立
　　 含5×10-4mol／L軟脂

9、酸的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞24h后,模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量較空白對(duì)照組減少約53.6％,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明軟脂酸孵育后細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的IR。
　　 2.熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞和RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定
　　 轉(zhuǎn)染后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞,可見熒光表達(dá),36h時(shí)熒光表達(dá)最強(qiáng)。RT-PCR測(cè)得FoxOl表達(dá)量軟脂酸誘導(dǎo)后較對(duì)照組表達(dá)量顯著增高。
　　 3.RT-PCR技術(shù)檢測(cè)FoxOl mRNA表達(dá)

10、>　　 各組細(xì)胞RT-PCR經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離,在467bp處可見清晰擴(kuò)增條帶,與目的條帶位置一致。RT-PCR測(cè)得FoxOl表達(dá)量軟脂酸誘導(dǎo)后較對(duì)照組表達(dá)量顯著增高,轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒后與軟脂酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,轉(zhuǎn)入含F(xiàn)oxOlsiRNA質(zhì)粒后FoxOl mRNA表達(dá)量較軟脂酸組顯著降低,約51.2％FoxOlmRNA被抑制,說明成功轉(zhuǎn)染pSIREN-DNR-DsRed-Express-FoxOl質(zhì)粒到細(xì)胞中,并有效地發(fā)揮抑制

11、效果。
　　 4.葡萄糖消耗量、細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和脂質(zhì)堆積
　　 含有5×10-4mol／L軟脂酸的培養(yǎng)液培養(yǎng)使細(xì)胞葡萄糖消耗降低,此降低效應(yīng)在抑制FoxOl后有所緩解,表現(xiàn)為:軟脂酸組和空白質(zhì)粒組葡萄糖消耗量均較對(duì)照組降低； FoxOlsiRNA組葡萄糖消耗量較軟脂酸組、空白質(zhì)粒組均明顯增加,但仍低于對(duì)照組,各組細(xì)胞增殖率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)堆積
　　 對(duì)照組細(xì)胞邊緣清晰,核

12、大,細(xì)胞內(nèi)未見橘紅色脂滴；軟脂酸誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)可見許多橘紅色的脂滴存在,且大部分細(xì)胞內(nèi)含多個(gè)脂滴；轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)仍可見有脂滴存在；轉(zhuǎn)染FoxOlsiRNA質(zhì)粒載體36h后細(xì)胞中橘紅色脂滴較軟脂酸組和空白質(zhì)粒組明顯減少。
　　 6.SREBP-lc mRNA和蛋白的表達(dá)
　　 RT-PCR測(cè)量轉(zhuǎn)入含F(xiàn)oxOlsiRNA質(zhì)粒載體后SREBP-lc mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加,較軟脂酸組明顯減少,約減少35.7％。

13、r>　　 Western blot測(cè)量轉(zhuǎn)入含F(xiàn)oxOlsiRNA質(zhì)粒載體后SREBP-lc蛋白表達(dá)量較對(duì)照組降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,較軟脂酸組明顯降低(P<0.01),約降低40.5％。
　　 結(jié)論：
　　 1.高濃度脂肪酸誘導(dǎo)誘導(dǎo)的HepG-2細(xì)胞中可發(fā)生脂質(zhì)堆積,導(dǎo)致胰島素抵抗。
　　 2.FoxOl升高／降低可加重／減輕HepG2細(xì)胞胰島素抵抗,其機(jī)制可能是上調(diào)／下調(diào)SREBP-lc表達(dá),增加／減少脂質(zhì)