通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT3和Wnt5a信號通路可能是缺血后處理及低溫減輕全腦缺血性腦損傷的分子機(jī)制.pdf

1、目前國內(nèi)外已經(jīng)有大量的試驗(yàn)證實(shí)低溫對全腦缺血的腦保護(hù)作用。低溫的腦保護(hù)作用不僅局限在減少能量代謝和氧耗，還具有抑制興奮性氨基酸釋放、抑制氧自由基的過度形成和細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)超載，明顯增加腦組織對缺血的耐受性。臨床心臟外科手術(shù)體外循環(huán)中已經(jīng)成功地將不同程度的低溫應(yīng)用于術(shù)中腦保護(hù)，特別是深低溫停循環(huán)技術(shù)應(yīng)用于部分嬰幼兒主動(dòng)脈弓部手術(shù)。
　　研究證實(shí)JAK蛋白和JAKs蛋白通路廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激、凋亡以及炎癥反應(yīng)和免

2、疫調(diào)節(jié)等過程。關(guān)于JAK-STAT途徑的研究大多集中在腫瘤、肝臟疾病、神經(jīng)細(xì)胞的生成、造血系統(tǒng)疾病和心臟病中研究較多。
　　Wnt基因編碼的Wnt蛋白家族屬于分泌型糖蛋白，它們通過旁分泌或自分泌作用與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，激活胞內(nèi)的各級信號傳導(dǎo)分子，調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Wnt/Ca2+通路主要由wnt5a和 wntll激活，可能通過 G蛋白激活PLC(Phospholipase C)和PKC(ProteinkinaseC)，從而

3、引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分的激活。近年來，該通路其在炎癥及凋亡中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。
　　基于以上的理論及研究結(jié)果，考慮到嬰幼兒主動(dòng)脈弓部手術(shù)，存在低溫、全腦缺血的過程，我們設(shè)計(jì)了該課題，以期探討JAK2-STAT3通路和Wnt5a非經(jīng)典信號通路是否參與低溫和缺血后處理介導(dǎo)腦保護(hù)的分子機(jī)制，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床應(yīng)用。本課題分為以下幾個(gè)部分：
　　第一部分 探討減輕全腦缺血性腦損傷的最佳缺血后處理方案

4、r>　　目的：探討減輕全腦缺血性腦損傷的最佳缺血后處理方案
　　方法：以成年雄性SD大鼠為研究對象，以四血管阻塞法，夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈20分鐘，建立大鼠全腦缺血模型為基本方法。開放雙側(cè)頸總動(dòng)脈再灌注前分別采取多種短暫性腦缺血后處理方案，后處理方案包括7組：缺血再灌注組、15秒×1次（15×1）組、15秒×3次（15×3）組、30秒×1次（30×1）組、30秒×3次（30×3）組、60秒×1次（60×1）組，空白組，每組8只SD大鼠。

5、48h后，檢測大鼠神經(jīng)功能損傷評分后，處死，行前腦切片HE染色和TUNEL染色，Western blot法檢測腦組織bcl-2、caspase-3的表達(dá)量，觀察不同缺血后處理方案對全腦缺血后再灌注腦組織的損傷情況。
　　結(jié)果：缺血再灌注組大鼠腦額頂葉皮質(zhì)及相應(yīng)的皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)可見明顯神經(jīng)元損傷，而且損傷程度最嚴(yán)重。與缺血再灌注組比較，五種缺血后處理方案均能減輕大全腦缺血再灌注所致的腦損傷，但減輕程度不一樣，其中，缺血后處理15x3組效

6、果最明顯。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，短暫性腦缺血后處理對大鼠全腦腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用。其中，缺血后處理15秒x3次方案可能是本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案中的最佳方案。
　　第二部分 缺血后處理及低溫通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　目的：（1）研究JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道在大鼠全腦腦缺血后的不同時(shí)間的表達(dá)。
　　（2）研究JAK2-STAT3和Wnt

7、5a非經(jīng)典信號通道在缺血后處理及深低溫條件下減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷中的作用。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設(shè)立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設(shè)一組，檢測大鼠神經(jīng)功能損傷評分，免疫組織化學(xué)法和western blot法分別檢測JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a，β-catenin的表達(dá)。

8、>　?。?）另外再設(shè)計(jì)7組實(shí)驗(yàn)，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經(jīng)處理后恢復(fù)灌注24h后檢測大鼠神經(jīng)功能損傷評分，同時(shí)通過western blot法檢測腦組織JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Wnt5a、的表達(dá)的蛋白表達(dá)水平。

9、　　結(jié)果：大鼠全腦腦缺血再灌注后，p-JAK2、p-STAT3、Wnt5a在大腦皮質(zhì)的表達(dá)24h達(dá)到高峰，JAK2、STAT3缺血24h表達(dá)最少，β-catenin表達(dá)變化不明顯。缺血后處理及低溫均可減輕全腦腦缺血再灌注腦損傷，兩個(gè)作用可以相互疊加，兩種保護(hù)措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結(jié)論：JAK2-STAT3和 Wnt5a非經(jīng)典信號通道在全腦腦缺血再灌注后早期被激活，24小時(shí)達(dá)到高峰。此外，缺血

10、后處理及低溫可能通過調(diào)節(jié)JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道減輕大鼠全腦腦缺血性再灌注腦損傷。
　　第三部分 通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道抑制炎癥反應(yīng)可能是缺血后處理及低溫減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷的機(jī)制之一。
　　目的：（1）探討大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷后炎癥反應(yīng)以及炎癥介質(zhì)不同時(shí)間的表達(dá)水平。
　?。?）進(jìn)一步探討是否通過JAK-STAT和Wnt5a非經(jīng)典信號通道抑制炎癥反應(yīng)，

11、從而減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設(shè)立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設(shè)一組，分別檢測髓過氧物酶(MPO)的表達(dá)含量，以免疫組織化學(xué)法和western blot法進(jìn)一步檢測缺血腦組織促炎癥因子TLR2、TLR4、NF-κB和COX-2的表達(dá)水平，用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α的含量。

12、　?。?）另外再設(shè)計(jì)8組實(shí)驗(yàn)，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、空白對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫組+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經(jīng)處理后恢復(fù)灌注24h后，分別檢測各組檢測髓過氧物酶(MPO)的表達(dá)含量，大腦組織TNF-α的分泌情況，通過western blot法檢測腦組織促炎癥因子COX-2、NF-κB

13、的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：炎癥標(biāo)志物MPO含量從腦缺血后24h達(dá)到高峰，維持至48h，到72小時(shí)逐漸下降，但仍高于正常水平。TLR2、TLR4、COX-2、NF-κB和 TNF-α的表達(dá)也于腦缺血后24h達(dá)到高峰。缺血后處理及低溫可降低全腦腦缺血再灌注腦損傷后的炎癥反應(yīng)以及促炎癥因子的表達(dá)水平，兩個(gè)作用可以相互疊加，兩種保護(hù)措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結(jié)論：大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷誘導(dǎo)炎癥反

14、應(yīng)和促炎癥因子的表達(dá)，24小時(shí)達(dá)到高峰。此外，缺血后處理及低溫通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)和炎癥反應(yīng)，這可能是減輕大鼠全腦腦缺血性再灌注腦損傷的機(jī)制之一。
　　第四部分 通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道抑制神經(jīng)元凋亡可能是缺血后處理及低溫減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷的機(jī)制之一。
　　目的：（1）探討大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷后不同時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元凋亡的水平。
　　

15、（2）進(jìn)一步探討是否通過JAK2-STAT3和Wnt5a非經(jīng)典信號通道抑制神經(jīng)元凋亡，從而減輕大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷。
　　方法：（1）以成年雄性SD大鼠為研究對象，建立大鼠常溫下全腦缺血模型，每組6只SD大鼠，設(shè)立空白對照組，在腦缺血在灌注后2h、6h、12h、24h、48h、72h各設(shè)一組，以Tunel染色法和western blot法進(jìn)一步檢測缺血腦組織bcl-2/BAX，caspase-3的表達(dá)水平。
　?。?）

16、另外再設(shè)計(jì)8組實(shí)驗(yàn)，每組6只SD大鼠，分為缺血再灌注對照組、空白對照組、缺血后處理組、低溫組、缺血后處理+低溫組、缺血后處理+低溫+AG490組、缺血后處理+低溫+特異性Ca2+抑制劑組、缺血后處理+低溫組+AG490+特異性Ca2+抑制劑組，全腦腦缺血經(jīng)處理后恢復(fù)灌注24h后，通過大腦HE染色及Tunel染色了解腦細(xì)胞凋亡情況，western blot法進(jìn)一步檢測缺血腦組織bcl-2/BAX，caspase-3的表達(dá)水平。
　　

17、結(jié)果：全腦腦缺血再灌注腦損傷后缺血腦組織發(fā)生神經(jīng)元凋亡，凋亡從腦缺血后開始，24h達(dá)到高峰，高峰期維持到48-72h，隨后降低，但仍高于正常水平。缺血后處理及低溫可降低全腦腦缺血再灌注腦損傷后的BAX、caspase-3的表達(dá)水平，升高bcl-2的表達(dá)水平，兩個(gè)作用可以相互疊加，兩種保護(hù)措施被AG490或特異性Ca2+抑制劑或二者混合物抑制。
　　結(jié)論：大鼠全腦腦缺血再灌注腦損傷誘導(dǎo)缺血腦組織神經(jīng)元凋亡，BAX、caspase-3