新型抗精神病藥哌羅匹隆與P-糖蛋白相互作用研究.pdf

1、一、目的： 通過(guò)考察哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響、P-糖蛋白與哌羅匹隆的親和力以及P-糖蛋白對(duì)哌羅匹隆跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，探討藥物與P-糖蛋白的相互作用。 二、方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及毒性試驗(yàn)Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞均采用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞免疫熒光法進(jìn)行P-糖蛋白表達(dá)驗(yàn)證。 用MTT法分別考察哌羅匹隆和維拉帕米對(duì)Caco-2細(xì)胞及ECV304細(xì)胞的毒性，選擇細(xì)胞存活率大于90

2、％的藥物濃度作為最大無(wú)毒濃度進(jìn)行下一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。 2.哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白功能的影響用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，考察哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明123外排作用的影響，從而判斷藥物對(duì)P-糖蛋白的功能有何影響。 3.哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響藥物與細(xì)胞作用72小時(shí)后采用RT-PCR技術(shù)分析哌羅匹隆對(duì)Caco-2細(xì)胞上MDRl基因mRNA表達(dá)水平的影響；用流式細(xì)胞術(shù)分析哌羅匹隆對(duì)Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白表達(dá)影響

3、。 4 哌羅匹隆與P-糖蛋白的體外親和力P-糖蛋白是利用細(xì)胞內(nèi)ATP酶水解釋放的能量將其底物泵出細(xì)胞，采用磷鉬藍(lán)法測(cè)定0.01-100gmol/L哌羅匹隆與P-糖蛋白膜共孵育時(shí)ATP酶活性變化，用米.曼式方程計(jì)算Vmax、Km、’Vmax/Km，得到藥物與P-糖蛋白的體外親和力。 5 P-糖蛋白對(duì)哌羅匹隆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響首先建立LTPLC-MS/MS測(cè)定哌羅匹隆的方法。 在建立好的Transwell單層細(xì)胞模型上研究哌

4、羅匹隆雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，考察P-糖蛋白功能改變前后哌羅匹隆轉(zhuǎn)運(yùn)的差異。用UPLC-MS/MS測(cè)定樣品的藥物濃度，計(jì)算表觀滲透系數(shù)。 三、結(jié)果： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞在正常條件下生長(zhǎng)旺盛，Caco-2細(xì)胞高表達(dá)P-糖蛋白，適合哌羅匹隆與P-糖蛋白相互作用研究用；對(duì)照細(xì)胞ECV304低表達(dá)P-糖蛋白，適合作陰性對(duì)照。 MTT結(jié)果顯示哌羅匹隆對(duì)Caco-2細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度為30μm

5、ol/L，維拉帕米在0.01-100Wnol/L濃度內(nèi)對(duì)Caco-2細(xì)胞沒(méi)有毒性。2種化合物在0.01-100μmol/L濃度內(nèi)對(duì)ECV304細(xì)胞無(wú)明顯毒性。因此確定哌羅匹隆系列濃度為0.01、0.1、1、10、30μmol/L，維拉帕米系列濃度為0.01、0.1、1、10、30、50μmol/L。 2.哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白功能的影響0.01-30gmol/L哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白介導(dǎo)的羅丹明123外排有顯著抑制作用(P<0.05

6、)，且呈劑量依賴性，30gmol/L哌羅匹隆使細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加429％。 3.哌羅匹隆對(duì)P-糖蛋白表達(dá)的影響在mRNA水平上：RT-PCR結(jié)果顯示0.01-30μmol/L哌羅匹隆組的目的條帶總灰度值與內(nèi)參總灰度值之比小于陰性組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)，哌羅匹隆對(duì)Caco-2細(xì)胞的MDR1基因mRNA表達(dá)水平有下調(diào)作用。 在蛋白水平上：在0.01-30μmol/L范圍內(nèi)，哌羅匹隆組熒光強(qiáng)度明顯低于陰性對(duì)照組(P<0

7、.05)，哌羅匹隆能顯著降低Caco-2細(xì)胞上P-糖蛋白的表達(dá)，30μmol/L藥物作用72小時(shí)后，P-糖蛋白表達(dá)量?jī)H為陰性對(duì)照組的10％左右。 4 哌羅匹隆與P-糖蛋白的體外親和力相同濃度下，P-糖蛋白與藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，ATP被水解后釋放的無(wú)機(jī)磷量越多；相同作用時(shí)間下，藥物濃度越高，ATP被水解后釋放的無(wú)機(jī)磷量越多；哌羅匹隆與P-糖蛋白親和力(Vmax/Km:1.3)小于維拉帕米與P-糖蛋白的親和力(Vmax//Km:2.6

8、)。 5 P-糖蛋白對(duì)哌羅匹隆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響未加入P-糖蛋白抑制劑維拉帕米時(shí)，低濃度(0.01μmol/L)哌羅匹隆的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)明顯差異(P>0.05)，中(1μmol/L)、高(30μmol/L)濃度B→A轉(zhuǎn)運(yùn)程度高于A→B轉(zhuǎn)運(yùn)；與維拉帕米共同作用時(shí)，3個(gè)濃度的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明P-糖蛋白在一定程度上參與了哌羅匹隆的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)其功能受到抑制時(shí)，藥物外排減少。 四、結(jié)論： 1.哌羅匹隆對(duì)P