PAK4與P54蛋白相互作用的驗證.pdf

1、目的：
　　 p21活化激酶(p21-activated kinase,PAK)為一類進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PAK在許多組織中廣泛表達,為Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac、生長因子和細胞外信號的下游主要靶蛋白,參與許多重要細胞活動。PAK家族共有6個家族成員:皆含有氨基末端(N-末端)調(diào)節(jié)區(qū)和羧基末端(C-末端)激酶區(qū)。根據(jù)它們結構特點及相似性,可分為兩大類:Ⅰ類PAK(PAK1-

2、PAK3)和Ⅱ類PAK(PAK4-PAK6)。兩類PAK在結構、活化方式、生物學功能上有著很大的區(qū)別,它們具有不同的下游靶蛋白。PAK4是目前研究的最為廣泛的Ⅱ類PAK,其功能特點比較明確。隨著PAK4下游蛋白的不斷發(fā)現(xiàn),已明確其在許多生物學活動如細胞骨架重排、細胞遷移、細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn),PAK4還參與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程。
　　 P54是本實驗室利用酵母雙雜交技術從人胎腦cDNA文庫中篩選出的PAK4新的相互

3、作用蛋白。P54蛋白是一種神經(jīng)特異性的蛋白,在神經(jīng)生長過程中能夠在生長核處富集,調(diào)節(jié)軸突的延伸,P54蛋白能夠在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和(CNS)周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中表達,是有效的微管不穩(wěn)定因子,膜相關蛋白。也有相關文章報道,P54蛋白與腫瘤有一定的聯(lián)系。P54的發(fā)現(xiàn)為PAK4腫瘤信號通路的進一步完善提供了新的依據(jù),為PAK4參與神經(jīng)元的發(fā)育以及遷移過程提供新的線索。本課題旨在證實PAK4與P54的相互作用關系,進而初步探討其生物學功能。

4、r>　　 實驗材料與方法
　　 一、實驗材料
　　 1、基因克隆相關分子生物學試劑。
　　 2、酵母雙雜交和酵母質(zhì)粒提取相關試劑。
　　 3、體外轉錄試劑盒。
　　 二、實驗方法
　　 1、順序轉染法篩選PAK4相互作用蛋白P54。
　　 2、在AH109酵母菌中驗證PAK4與P54相互作用。
　　 3、在大腸菌BL21中誘導P54蛋白的表達并純化。
　　 4、利

5、用GST-pull down實驗體外驗證PAK4與P54相互作用。
　　 5、利用免疫沉淀驗證PAK4與P54在體內(nèi)相互作用。
　　 6、利用免疫熒光方法觀察P54亞細胞定位及與PAK4的共定位。
　　 結果
　　 酵母雙雜交實驗篩選出PAK4新的相互作用蛋白P54,將其共轉到AH109酵母菌中,進行酵母體內(nèi)驗證,結果顯示兩者能夠相互作用。GST-pull down實驗結果進一步證實了兩者在體外的相互作用

6、。免疫沉淀實驗驗證了兩者的體內(nèi)相互作用。通過共聚焦顯微鏡觀察P54蛋白定位在細胞漿,且P54與PAK4兩者在細胞漿有共定位。
　　 結論
　　 1、P54是PAK4新的相互作用蛋白。
　　 2、通過酵母雙雜交共轉染技術,驗證了PAK4與P54之間發(fā)生相互結合。
　　 3、通過體內(nèi)IP和體外GST-pull down實驗證實PAK4能與P54相互作用。
　　 4、通過共聚焦實驗證實P54定位在細胞漿