抗精神病藥喹硫平治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)放療、化療不敏感，導(dǎo)致其臨床治愈率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率居高不下，患者5年存活率不到5％。因此，探尋該疾病行之有效的治療途徑，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的生物學(xué)治療途徑至關(guān)重要。
　　膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem-like cells，GSLCs)是膠質(zhì)瘤組織中存在的極少數(shù)具有高度抵抗放療和化療的細(xì)胞，具有無(wú)限增殖和多向分化能力，可以分化為神經(jīng)元表型細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞表型細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞表型細(xì)胞。GSLCs概念的提出為膠質(zhì)瘤治療

2、提供了重要靶點(diǎn)，因此尋找能夠促進(jìn)GSLCs定向分化藥物可能為臨床治療膠質(zhì)瘤提供新的途徑。
　　流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一個(gè)有趣的現(xiàn)象:精神分裂癥患者的腫瘤發(fā)病率比正常人群明顯減少。研究人員發(fā)現(xiàn)多種抗精神病藥如氯丙嗪、奧氮平、利培酮等，均能明顯抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR32細(xì)胞增生，且對(duì)正常細(xì)胞影響甚微。喹硫平(Quetiapine，QUE)是繼氯氮平、利培酮和奧氮平之后的第4個(gè)非典型抗精神病藥物。本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)喹硫平能顯著增加

3、神經(jīng)干細(xì)胞(neuronal stem cells，NSCs)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例，并能進(jìn)一步促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟及髓鞘形成。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)QUE能促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)分化成熟，考慮GSLCs與NSCs，OPCs關(guān)系密切，我們提出QUE可能具有抑制GSLCs增殖及促進(jìn)GSLCs定向分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞表型的潛能。
　　本研究利用GSLCs培養(yǎng)和移

4、植成瘤模型，研究了QUE對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的作用，及其與膠質(zhì)瘤一線治療藥物替莫唑胺(Temozolomide，TMZ)的聯(lián)合藥效，探討了QUE對(duì)GSLCs增殖分化的調(diào)節(jié)作用及可能的分子機(jī)制
　　研究總共分為三個(gè)部分:
　　第一部分:喹硫平抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)的作用
　　利用無(wú)血清條件培養(yǎng)系統(tǒng)從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL261中篩選獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，建立膠質(zhì)瘤原位及皮下成瘤模型，分別采用QUE、TMZ以及二者聯(lián)合治療等方式，運(yùn)用熒光

5、素酶活體成像技術(shù)、動(dòng)物行為學(xué)、HE染色、免疫組織化學(xué)和Western blot等方法檢測(cè)各種治療方式對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)生和生長(zhǎng)特性的作用。最后為了進(jìn)一步檢驗(yàn)QUE可能作用于GSLCs而抑制膠質(zhì)瘤的產(chǎn)生或生長(zhǎng)。我們分別對(duì)GSLCs移植裸鼠皮下成瘤以及腦室成瘤后使用TMZ21天來(lái)殺死腫瘤細(xì)胞，停藥后再分別給予生理鹽水和QUE治療，利用熒光素酶活體成像技術(shù)觀察膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)情況。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.免疫熒光染色顯示無(wú)血清培養(yǎng)條件下

6、篩選GL261獲得的細(xì)胞表達(dá)腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)標(biāo)記物CD133、Sox2、NG2和Nestin，加入10％胎牛血清分化10天后大部分細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，少部分表達(dá)髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)。以上結(jié)果表明所獲得細(xì)胞具有膠質(zhì)瘤干細(xì)胞特性，為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞GSLCs。
　　2.GS

7、LCs皮下移植裸后7天后可見(jiàn)小的瘤體形成，21天后瘤體平均直徑達(dá)到1.5cm，而QUE處理組、TMZ處理組及QUE聯(lián)合TMZ組，成瘤時(shí)間均有所推遲，瘤體平均體積也小于對(duì)照組，其中尤以QUE聯(lián)合TMZ療效最明顯。組織學(xué)病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，治療組明顯減少了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的分裂潛能，即核分裂像減少，增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen，PCNA)陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少。而同對(duì)照組相比，治療組，尤其是QUE和TMZ

8、聯(lián)合治療組，Olig2陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，而MBP陽(yáng)性細(xì)胞則明顯增多(P＜0.01)。Western blot結(jié)果顯示QUE和QUE聯(lián)合TMZ治療組MBP表達(dá)明顯增多，而Vimentin，GFAP表達(dá)下降(P＜0.05)。
　　3.GSLCs腦室移植后，活體熒光成像顯示小鼠于1周后出現(xiàn)腫瘤，而QUE，TMZ治療后腫瘤大小有所減少，而二者聯(lián)合用藥后腫瘤最小，動(dòng)物成活率增加。行為學(xué)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，藥物治療組小鼠較原位腦膠質(zhì)瘤模型小鼠活動(dòng)總

9、路程明顯提高(P＜0.05)，提示其活動(dòng)能力保留較好。QUE對(duì)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)有抑制作用，而且QUE聯(lián)合替莫唑胺能更好抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，降低其惡性程度。
　　4.TMZ治療21天后腫瘤生長(zhǎng)明顯抑制，但停藥后1周后，殘留的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)至瘤。而QUE處理組，腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，大小明顯減小(P＜0.05)。說(shuō)明QUE可能抑制GSLCs增殖或促進(jìn)其分化。
　　本部分實(shí)驗(yàn)說(shuō)明QUE對(duì)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，而且QUE聯(lián)合替莫唑胺

10、能更好抑制膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，降低其惡性程度。這些結(jié)果提示QUE可能對(duì)GSLCs生長(zhǎng)分化有一定的影響。
　　第二部分:喹硫平對(duì)腫瘤干細(xì)胞增殖及分化的作用
　　為了證明QUE可能作用于GSLCs而抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的產(chǎn)生或生長(zhǎng)。我們利用無(wú)血清條件培養(yǎng)系統(tǒng)從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系GL261中篩選獲得膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，用MTT，RT-PCR，流式細(xì)胞檢測(cè)等技術(shù)觀察不同濃度QUE對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖作用。用免疫熒光及Western blot來(lái)檢測(cè)不同濃

11、度QUE對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化作用。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.體外實(shí)驗(yàn)顯示QUE濃度50、100μ mol/L能明顯抑制GSLCs的生長(zhǎng)，懸浮的球團(tuán)明顯小于對(duì)照組(P＜0.01)。MTT實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了QUE的抑制效應(yīng)(P＜0.01)。流式細(xì)胞檢測(cè)中QUE明顯減少S期細(xì)胞(P＜0.05)，而且能顯著減少膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中Sox2及Ki67的基因表達(dá)(P＜0.01)。
　　2.以1％胎牛血清誘導(dǎo)GSLCs分化過(guò)程中，QUE處理可

12、顯著提高少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟蛋白MBP及CC1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù);而且濃度依賴(lài)性降低干細(xì)胞因子Sox2，Olig2蛋白表達(dá)(P＜0.05)，而升高少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)因子MBP，Olig1蛋白表達(dá)(P＜0.05)。
　　本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明QUE能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖并且能促進(jìn)其向類(lèi)似少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。
　　第三部分:喹硫平促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化的分子機(jī)制初探
　　由于Wnt/β-catenin通路在GSLCs增殖分化中發(fā)揮了至關(guān)重要的作

13、用，而且QUE的抗精神病的藥物機(jī)制也涉及該途徑，所以我們利用免疫組化及Western blot等技術(shù)檢測(cè)了離體在體中QUE對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.在體實(shí)驗(yàn)中，免疫組化顯示對(duì)照組β-catenin在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)較多并且有入核現(xiàn)象，而QUE組中β-catenin在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)較少。Western blot顯示QUE組中p-GSK-3β(ser9)減少(p＜0.01)

14、，促進(jìn)β-eatenin降解，導(dǎo)致β-eatenin表達(dá)減少(p＜0.01)。
　　2.在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化過(guò)程中，QUE可以減少p-GSK-3β(ser9)的表達(dá)，提高磷酸化β-catenin(P-β-catenin)而降低β-catenin水平(P＜0.05)。這種作用呈時(shí)間濃度依賴(lài)性。而且這種作用可以被Wnt/β-catenin通路激活劑QS11和LiCl拮抗。
　　本部分實(shí)驗(yàn)說(shuō)明QUE可能通過(guò)激活GSK-3β，使β-c