CYP450和P-糖蛋白與雙環(huán)醇及布格呋喃的相互作用.pdf

1、雙環(huán)醇(4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-雙(亞甲二氧基)-2.羥甲基-2’-甲氧羰基聯(lián)苯)是具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，治療慢性病毒性肝炎的國(guó)家一類(lèi)新藥。臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙環(huán)醇可明顯改善慢性乙型肝炎和丙型肝炎患者的臨床癥狀及肝功能異常，同時(shí)兼有一定抗乙型肝炎病毒作用。前期藥效學(xué)研究表明，雙環(huán)醇對(duì)多種化學(xué)毒物如四氯化碳、D-半乳糖胺、脂多糖、刀豆蛋白A引起的化學(xué)性及免疫性肝損傷均有明顯保護(hù)作用，其作用機(jī)制與調(diào)控前炎癥因子及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑

2、制氧化損傷、保護(hù)線(xiàn)粒體功能密切相關(guān)[2-4]。此外，藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，雙環(huán)醇水溶性差，口服給藥后半衰期較短，生物利用度低，臨床需要多次服藥。雙環(huán)醇在大鼠體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A代謝，代謝產(chǎn)物為4-羥基雙環(huán)醇和4’-羥基雙環(huán)醇，與在人肝微粒體的代謝產(chǎn)物一致。 布格呋喃(4-丁基-α-沉香呋喃)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研發(fā)的具有較強(qiáng)中樞鎮(zhèn)靜作用的抗焦慮新藥。前期研究表明，布格呋喃口服后半衰期短，生物利用度較低(～8％)，多次給藥對(duì)藥

3、物代謝Ⅰ相酶CYP1A、2E、3A、2C、2D和Ⅱ相酶GST及GR有不同程度的誘導(dǎo)作用。布格呋喃在大鼠體內(nèi)主要經(jīng)過(guò)CYP3A和CYP2E代謝，此外布格呋喃也是P-糖蛋白的底物之一。 本論文應(yīng)用Caco-2細(xì)胞、大鼠在體腸/肝灌流及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)模型，探討雙環(huán)醇/布格呋喃口服生物利用度低的原因及分子機(jī)制，了解腸道和肝臟各自在上述藥物首過(guò)效應(yīng)中的作用。同時(shí)，比較雙環(huán)醇/布格呋喃在正常和肝腎損傷大鼠腸/肝的吸收，代謝以及轉(zhuǎn)運(yùn)規(guī)律，研究

4、兩藥與藥物代謝酶和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用，為深入了解新藥在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化機(jī)制和臨床合理用藥提供有實(shí)用價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究結(jié)果表明： 1.大鼠口服雙環(huán)醇(200mg/kg)后5min血中即可檢測(cè)到原形藥，達(dá)峰時(shí)間為4.6h，達(dá)峰濃度為6.6μg/ml，AUC0→∞為18.5μg/ml·h。大鼠靜脈注射雙環(huán)醇(20mg/kg)后，全身清除率(CL)為33.1ml/min/kg，消除半衰期(T1/2)為0.7h，AUC0→∞

5、為13.4μg/ml·h。由此計(jì)算大鼠口服雙環(huán)醇的生物利用度為13.8％。此外，大鼠靜脈注射雙環(huán)醇(20mg/kg)24h內(nèi)，膽汁和尿液中雙環(huán)醇含量分別占給藥量的0.3％和0.5％。上述結(jié)果提示，雙環(huán)醇口服生物利用度低，且靜脈注射后主要在肝臟發(fā)生生物轉(zhuǎn)化。 2.大鼠提前靜脈注射CYP450抑制劑氨基苯并三唑(Aminobenzotriazole，ABT)50mg/kg或口服100mg/kg后，雙環(huán)醇(200mg/kg)口服給藥組

6、大鼠的AUC0→∞分別為223.1和456.8μg/ml·h，雙環(huán)醇(20mg/ml)靜脈注射給藥組大鼠的AUC0→∞、CL和T1/2分別為65和58μg/ml·h、5.1和5.8ml/min/kg、5.3和6.5h，生物利用度分別為30.9和84％。以上結(jié)果表明，提前給予ABT(i.v或P.0)可通過(guò)抑制腸道或腸道和肝臟的CYP450活性，明顯提高雙環(huán)醇的口服生物利用度(1.2或5.1倍)。 3.在大鼠single-pass腸

7、灌流實(shí)驗(yàn)中可觀察到腸系膜靜脈血中雙環(huán)醇累積量隨灌流液中雙環(huán)醇濃度(10、50、100μM)的增加而增加，分別為103、158和1547pm/cm2。如在雙環(huán)醇(50μM)灌流液中分別加入P-糖蛋白，CYP3A以及CYP3A和P-糖蛋白的共同抑制劑LSN335984，醋竹桃酶素(Triacetyloleandomycin，TAO)和環(huán)孢素A(CyclosporineA，CsA)后，大鼠腸系膜靜脈血中雙環(huán)醇累積量分別為508、2000和21

8、10pm/cm2，與對(duì)照組比較分別增加3、12和16倍。而CYP3A的常用底物咪噠唑侖在加入LSN335984后，血中累積量無(wú)明顯變化。此外，在加入LSN335984，TAO和CsA后，與對(duì)照組相比雙環(huán)醇在腸道代謝分別減少9％、33％和36％。提示雙環(huán)醇不僅是CYP3A的底物，同時(shí)也是P-糖蛋白的底物，CYP3A和P-糖蛋白的聯(lián)合作用對(duì)雙環(huán)醇在腸道吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的影響是造成雙環(huán)醇口服生物利用度低的主要因素之一。 4.雙環(huán)醇(5

9、0μM)經(jīng)Caco-2細(xì)胞的的吸收滲透系數(shù)(Papp)為1.6±0.3×10-3cm/s，攝取比(ExtractionRatio，ER)為1.94，加入LSN335984后上述參數(shù)降低49％。以上結(jié)果從體外細(xì)胞水平證實(shí)雙環(huán)醇是P-糖蛋白底物的可能性。 5.大鼠肝臟灌流實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入TAO和CsA后灌流液中雙環(huán)醇的AUC0→∞1h和肝臟累積量明顯增加；而加入LSN335984后膽汁中雙環(huán)醇的累積量則明顯減少。提示抑制肝臟CYP3A

10、可明顯減少雙環(huán)醇代謝，而抑制p-糖蛋白后則使雙環(huán)醇外排至膽汁中的藥量減少。 6.雙環(huán)醇多次給藥(200mg/kg，qd×7d)后對(duì)大鼠肝CYP1A和CYP2E的酶活性有一定誘導(dǎo)作用。RT-PCR結(jié)果表明，雙環(huán)醇多次給藥可在一定程度誘導(dǎo)肝CYP1A2、CYP3A2以及腸mdrlamRNA的表達(dá)。此外，雙環(huán)醇(10μM)體外對(duì)CYP1A、CYP2C、CYP2E和CYP3A活性有一定抑制作用，而雙環(huán)醇(1μM)對(duì)大鼠上述各CYP450

11、同工酶無(wú)明顯影響。 7.大鼠腹腔注射化學(xué)毒物四氯化碳(2.5ml/kg，i.p)后可造成急性肝損傷，表現(xiàn)為血清ALT和AST分別升高6.2和1.3倍。正常動(dòng)物靜脈注射雙環(huán)醇(20mg/kg)后AUC0→∞和Cmax分別為13.4μg/ml·h和18.8μg/ml；而CCl4損傷組大鼠上述藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均明顯升高，AUC0→∞和Cmax為130μg/ml和33.1μg/ml·h，口服生物利用度增加了3.1倍。另將CCl4肝損傷大鼠

12、進(jìn)行腸循環(huán)灌流術(shù)后，可見(jiàn)腸系膜靜脈血和灌流液中雙環(huán)醇水平均明顯增加，而肝灌流后膽汁中雙環(huán)醇累積量減少75％。此外，CYP2C、CYP2E和CYP3A的特異性底物和雙環(huán)醇本身在模型組大鼠肝微粒體中的代謝也明顯減少。由此可見(jiàn)，肝損傷后雙環(huán)醇在大鼠腸道的吸收和肝臟代謝明顯改變，而且由于雙環(huán)醇在體內(nèi)主要經(jīng)CYP3A代謝轉(zhuǎn)化，因此推測(cè)參與雙環(huán)醇代謝的CYP3A活性的減少可能是肝損傷大鼠雙環(huán)醇口服生物利用度增加的主要原因。 8.大鼠肌肉注射

13、甘油(5ml/kg，i.m)后可造成急性腎損傷，同時(shí)肝功能也發(fā)生明顯改變。與正常組比較，模型組大鼠血清中尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)分別升高8.3和4.2倍，ALT和AST也分別升高4.7和1.7倍。血漿藥代動(dòng)力學(xué)研究表明，正常動(dòng)物口服雙環(huán)醇(200mg/kg)后AUC0→∞和Cmax分別為21μg/ml·h和6.7μg/ml：而甘油損傷組大鼠上述藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均明顯升高，AUC0→∞和Cmax為81.9μg/ml·h和7.8μg/

14、ml，口服生物利用度增加了3.6倍。由于腎損傷大鼠體內(nèi)全身清除率無(wú)明顯變化，推測(cè)腎臟損傷對(duì)雙環(huán)醇的藥代動(dòng)力學(xué)影響不大，而肝臟功能明顯受損，所以本實(shí)驗(yàn)選用腸/肝灌流模型用以觀察雙環(huán)醇在病理腎損傷大鼠藥代動(dòng)力學(xué)變化。腎損傷大鼠腸循環(huán)灌流實(shí)驗(yàn)中，腸系膜靜脈血和灌流液中雙環(huán)醇濃度的變化趨勢(shì)與肝損傷模型相近，均明顯增加。此外，CYP2C、CYP2E和CYP3A的特異性底物和雙環(huán)醇在腎損傷大鼠肝微粒體中的代謝明顯減少。 9.在大鼠singl

15、e-pass腸灌流模型中加入LSN335984、TAO和CsA后，大鼠腸系膜靜脈血中布格呋喃累積量分別為73.4、82.9和98.3pm/cm2，與對(duì)照組比較分別增加3.9、4.6和5.6倍，代謝分別減少12％、11％和21％。上述結(jié)果表明，布格呋喃不僅是CYP450的底物，同時(shí)也是P-糖蛋白的底物，腸道CYP3A和P-糖蛋白的聯(lián)合作用對(duì)布格呋喃吸收，轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的影響可能是導(dǎo)致布格呋喃口服生物利用度低的一個(gè)重要因素。 10.在大

16、鼠肝灌流模型中加入TAO和CsA灌流液中布格呋喃的AUC0→1h和肝累積量均明顯增加；加入LSN335984后，膽汁中布格呋喃累積量則明顯減少。提示抑制肝臟CYP3A可明顯減少布格呋喃代謝，而抑制P-糖蛋白后則使布格呋喃在膽汁中外排量減少。 11.在AHF大鼠腸道灌流模型中，腸灌流液和腸系膜靜脈血中布格呋喃的量均顯著增加。同時(shí)肝灌流液和肝組織中布格呋喃的量也明顯升高。上述結(jié)果提示，肝組織和灌流液中布格呋喃水平的變化可能與AHF大

17、鼠肝臟代謝能力降低有關(guān)。 12.在ARF大鼠腸灌流模型中，腸系膜靜脈血和腸組織中布格呋喃的量明顯增加，以上結(jié)果提示腸系膜靜脈血和腸組織中布格呋喃水平的變化可能與ARF大鼠模型中P-糖蛋白功能受到抑制，對(duì)底物外排作用減少，腸道吸收增加有關(guān)。 綜上所述，大鼠口服雙環(huán)醇后主要在腸道發(fā)生首過(guò)代謝。除溶解度外，腸道CYP3A和P-糖蛋白的聯(lián)合作用對(duì)雙環(huán)醇/布格呋喃的吸收、代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)影響是導(dǎo)致其口服生物利用度低的主要原因。在肝損傷時(shí)